Het verkennen van arteriële gladde spier KV7 Kalium Kanaal Functie met Patch Clamp Elektrofysiologie en druk myografie

Summary

Metingen van KV7 (KCNQ) kaliumkanaal activiteit in geïsoleerde bloedvaten myocyten (met behulp van patch-clamp elektrofysiologische technieken), parallel met metingen van constrictor / dilatator reacties (met behulp van druk myografie) kunnen belangrijke informatie over de rol van KV7 kanalen in het gladde spierweefsel fysiologie en farmacologie.

Abstract

Contractie of relaxatie van gladde spiercellen in de wanden van slagaders weerstand bepaalt de vaatdiameter en daardoor regelt bloedstroom door het vat en bijdraagt ​​aan systemische bloeddruk. De contractie wordt primair gereguleerd door cytosolische calciumconcentratie ([Ca ^{2 +]} _cyt), die op zijn beurt gecontroleerd door verschillende vervoerders en ion kanalen. Ion-kanalen zijn vaak tussenproducten in signaaltransductie pathways geactiveerd door vasoactieve hormonen aan vasoconstrictie of vaatverwijding te bewerkstelligen. En ionenkanalen worden vaak doelwit van therapeutische middelen opzettelijk (bijv. calciumantagonisten gebruikt om vaatverwijding en een lagere bloeddruk te wekken) of onbedoeld (bijvoorbeeld om ongewenste cardiovasculaire bijwerkingen veroorzaken).

KV7 (KCNQ) voltage-geactiveerde kaliumkanalen zijn onlangs betrokken als belangrijke fysiologische en therapeutische Targets voor de regulering van gladde spiercontractie. De specifieke rollen van KV7 kanalen in zowel fysiologische signaaltransductie en de acties van therapeutische middelen toe te lichten, moeten we onderzoeken hoe hun activiteit gemoduleerd op cellulair niveau en evalueren hun bijdrage in de context van het intacte slagader.

De rat mesenteriale slagaders zorgen voor een bruikbaar model systeem. De aders kunnen gemakkelijk worden ontleed, ontdaan van bindweefsel en gebruikt om geïsoleerde arteriële myocyten voorbereiden patch clamp elektrofysiologie of canule en druk metingen van vasoconstrictor / vaatverwijdende reacties onder relatief fysiologische omstandigheden. Hier beschrijven we de methoden voor beide metingen geven enkele voorbeelden van de proefopzet kan worden geïntegreerd om een ​​beter begrip van de rol van deze ionkanalen in de regulatie van de vasculaire tonus geven.

Protocol

1. Chirurgische excisie van de dunne darm Mesenteriale Vasculaire Arcade Verdoven een 300-400 g Sprague-Dawley ratten met isofluraan (4%) toegediend door inhalatie. Voer een middellijn laparotomie naar de dunne darm mesenterium bloot te leggen. Exterioriseren de dunne en dikke darm door de abdominale incisie met grote voorzichtigheid om trauma te voorkomen blootgestelde darm en mesenterium. Voorzichtig uitwaaieren het mesenterium uit over steriel gaas. Chirurgisch Snijd de dunne darm en ee…

Discussion

De methoden en experimentele benaderingen hier beschreven zijn zeer robuust en kan produceren duidelijke en reproduceerbare resultaten bij toepassing met nauwgezette aandacht voor detail. Goede elektrofysiologische opnames en vernauwing / verwijding van slagadersegmenten zijn afhankelijk van de gezondheid van de cellen en slagader segmenten respectievelijk. Celpreparaten kan van dag tot dag, zelfs met hetzelfde protocol. Isolatie oplossingen worden toegepast tot 2 weken, maar indien de kwaliteit van het celpreparaat laa…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S5886	Dissecting Solution: 145 Bath solution for Electrophysiology*: 140 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 140 Bath solution for pressure myography: 145 Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride	Sigma	P5405	Dissecting Solution: 4.7 Bath solution for Electrophysiology*: 5.36 Internal solution for electrophysiology: 135 Isolation solution for myocytes*: 5.36 Bath solution for pressure myography: 4.7 Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA	Sigma	E4378	Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES	Sigma	H9136	Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate	Sigma	S5136	Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate	Sigma	P5655	Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride	Sigma	M2393	Bath solution for Electrophysiology*: 1.2 Internal solution for electrophysiology: 1 Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride	Sigma	C7902	Bath solution for Electrophysiology*: 2 Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate	Fisher Scientific	BP331-1	Dissecting Solution: 1.2 Bath solution for pressure myography: 1.2 Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643	Dissecting Solution: 1.17 Bath solution for pressure myography: 1.17 Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	Dissecting Solution: 3 Bath solution for pressure myography: 3 Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid	Sigma	P4562	Dissecting Solution: 2 Bath solution for pressure myography: 2 Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate	Research Organics	9572E	Dissecting Solution: 0.02 Bath solution for pressure myography: 0.02 Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose	Sigma	G7021	Dissecting Solution: 5 Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 20 Isolation solution for myocytes*: 10 Bath solution for pressure myography: 5 Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin	Sigma	A3912	Dissecting Solution: 1% Lumen solution for pressure myography: 1%
pH			Dissecting Solution: 7.4 Bath solution for Electrophysiology*: 7.3 Internal solution for electrophysiology: 7.2 Isolation solution for myocytes*: 7.2 Bath solution for pressure myography: 7.4 Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity			Dissecting Solution: 300 Bath solution for Electrophysiology*: 298 Internal solution for electrophysiology: 298 Isolation solution for myocytes*: 298 Bath solution for pressure myography: 300 Lumen solution for pressure myography: 300
			*11
			Table 1. Components of solutions used in the experiment.