Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

Summary

Medidas do KV7 atividade do canal (KCNQ) de potássio em miócitos isolados arteriais (usando patch braçadeira técnicas eletrofisiológicas) em paralelo com medidas de constritores / dilatador respostas (usando Miografia pressão) pode revelar informações importantes sobre os papéis do KV7 canais em fisiologia do músculo liso vascular e farmacologia.

Abstract

Contracção ou relaxamento das células do músculo liso nas paredes das artérias de resistência determina o diâmetro da artéria e, assim, controla o fluxo de sangue através do vaso e contribui para a pressão arterial sistémica. O processo de contracção é regulado principalmente pela concentração de cálcio citosólico ([Ca ^{2 +]} _cit), que por sua vez é controlada por uma variedade de transportadores de iões e de canais. Canais iônicos são intermediários comuns em vias de transdução de sinal ativadas por hormônios vasoativas para efetuar vasoconstrição ou vasodilatação. E canais de iões são frequentemente alvo de agentes terapêuticos, quer intencionalmente (por exemplo, bloqueadores de canal de cálcio utilizado para induzir a vasodilatação e baixa pressão arterial) ou não intencionalmente (por exemplo, para induzir a indesejados efeitos secundários cardiovasculares).

KV7 (KCNQ) dos canais de potássio activados têm sido recentemente implicada como targ fisiológico e terapêutico importanteets para a regulação da contração do músculo liso. Para elucidar as funções específicas de canais em ambos KV7 transdução de sinal fisiológico e na acção dos agentes terapêuticos, é necessário estudar o modo como a sua actividade é modulada a nível celular, bem como de avaliar a sua contribuição no contexto da artéria intacta.

As artérias mesentéricas de rato proporcionar um sistema modelo útil. As artérias podem ser facilmente dissecados, limpos de tecido conjuntivo, e usada para preparar isolados miócitos arteriais em patch clamp electrofisiologia, ou canulada e pressurizado para medições de vasoconstritor / vasodilatador respostas sob condições relativamente fisiológicas. Aqui descrevemos os métodos utilizados para ambos os tipos de medições e fornecer alguns exemplos de como o projeto experimental pode ser integrado para fornecer uma compreensão mais clara dos papéis desses canais iônicos na regulação do tônus ​​vascular.

Protocol

1. Excisão cirúrgica da arcada vascular intestinal mesentérica Pequeno Anestesiar um 300-400 g de rato Sprague-Dawley, com isoflurano (4%), administrada por inalação. Executar uma laparotomia mediana para expor o mesentério do intestino delgado. Exteriorizar o intestino delgado e grosso através da incisão abdominal com grande cuidado, para evitar o trauma para o intestino expostos e mesentério. Gentilmente ventile o mesentério ao longo de gaze estéril. Cirurgicamente excisar o i…

Discussion

Os métodos e abordagens experimentais aqui descritas são bastante robustos e podem produzir resultados claros e reprodutíveis quando aplicado com atenção meticulosa aos detalhes. Boas gravações electrofisiológicos e constrição / dilatação dos segmentos arteriais são dependentes da saúde das células e os segmentos de artéria, respectivamente. Preparações de células pode variar de dia para dia, mesmo usando o mesmo protocolo. Soluções de isolamento podem ser utilizadas durante até 2 semanas, mas, se …

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S5886	Dissecting Solution: 145 Bath solution for Electrophysiology*: 140 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 140 Bath solution for pressure myography: 145 Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride	Sigma	P5405	Dissecting Solution: 4.7 Bath solution for Electrophysiology*: 5.36 Internal solution for electrophysiology: 135 Isolation solution for myocytes*: 5.36 Bath solution for pressure myography: 4.7 Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA	Sigma	E4378	Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES	Sigma	H9136	Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate	Sigma	S5136	Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate	Sigma	P5655	Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride	Sigma	M2393	Bath solution for Electrophysiology*: 1.2 Internal solution for electrophysiology: 1 Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride	Sigma	C7902	Bath solution for Electrophysiology*: 2 Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate	Fisher Scientific	BP331-1	Dissecting Solution: 1.2 Bath solution for pressure myography: 1.2 Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643	Dissecting Solution: 1.17 Bath solution for pressure myography: 1.17 Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	Dissecting Solution: 3 Bath solution for pressure myography: 3 Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid	Sigma	P4562	Dissecting Solution: 2 Bath solution for pressure myography: 2 Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate	Research Organics	9572E	Dissecting Solution: 0.02 Bath solution for pressure myography: 0.02 Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose	Sigma	G7021	Dissecting Solution: 5 Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 20 Isolation solution for myocytes*: 10 Bath solution for pressure myography: 5 Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin	Sigma	A3912	Dissecting Solution: 1% Lumen solution for pressure myography: 1%
pH			Dissecting Solution: 7.4 Bath solution for Electrophysiology*: 7.3 Internal solution for electrophysiology: 7.2 Isolation solution for myocytes*: 7.2 Bath solution for pressure myography: 7.4 Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity			Dissecting Solution: 300 Bath solution for Electrophysiology*: 298 Internal solution for electrophysiology: 298 Isolation solution for myocytes*: 298 Bath solution for pressure myography: 300 Lumen solution for pressure myography: 300
			*11
			Table 1. Components of solutions used in the experiment.