Exploring arteriella glatta muskel KV7 Funktion kaliumkanal med Elektrofysiologi Patch Clamp och tryck Myography

Summary

Mätningar av KV7 (KCNQ) kalium kanal aktivitet i isolerade arteriella myocyter (med patch clamp elektrofysiologiska tekniker) parallellt med mätningar av constrictor / dilator svar (med tryck myography) kan avslöja viktig information om roller KV7 kanaler i vaskulär glatt muskulatur fysiologi och farmakologi.

Abstract

Sammandragning eller avslappning av glatta muskelceller i väggarna i motståndet artärer bestämmer artären diameter och därmed styr blodflödet genom kärlet och bidrar till det systemiska blodtrycket. Kontraktionen Processen regleras primärt av cytosolisk kalciumkoncentration ([Ca ^{2 +]} _CYT), som i sin tur styrs av en mängd olika jon transportörer och kanaler. Jonkanaler är vanliga mellanprodukter i signaltransduktionsvägar som aktiveras av vasoaktiva hormoner för att åstadkomma vasokonstriktion eller vasodilatation. Och jonkanaler ofta måltavla för läkemedel uppsåtligen (t.ex. kalciumkanalblockerare som används för att framkalla vasodilatation och lägre blodtryck) eller oavsiktligt (t.ex. för att framkalla oönskade kardiovaskulära biverkningar).

KV7 (KCNQ) spänning-aktiverade kaliumkanaler har nyligen varit inblandad som viktiga fysiologiska och terapeutiska TargETS för reglering av kontraktion av glatt muskulatur. Att belysa specifika roller KV7 kanaler i både fysiologiska signaltransduktion och handlingar terapeutiska medel, måste vi studera hur deras aktivitet moduleras på cellnivå samt utvärdera deras bidrag i samband med den intakta artären.

Råtta mesenteriska artärer ger en användbar modell-system. Artärerna kan lätt dissekeras, rengörs från bindväv, och användes för att framställa isolerade arteriella myocyter för patch-clamp-elektrofysiologi, eller kanyleras och trycksattes för mätning av kärlsammandragande / vasodilaterande svar under relativt fysiologiska betingelser. Här beskriver vi de metoder som används för båda typer av mätningar och ge några exempel på hur den experimentella designen kan integreras för att ge en bättre förståelse för de roller dessa jonkanaler i regleringen av vaskulär ton.

Protocol

1. Kirurgisk excision av tunntarmen mesenterica Vaskulär Arcade Söva en 300-400 g Sprague-Dawley-råtta med isofluran (4%) administreras genom inhalation. Utför en mittlinje laparotomi att exponera tunntarmen tarmkäxet. Exteriorize den lilla och stora tarmen genom buksnitt med stor omsorg för att undvika trauma till exponerade tarm och tarmkäx. Försiktigt lufta krös ut över steril gasbinda. Kirurgiskt punktskatt tunntarmen och en del av tjocktarmen, inklusive blindtarmen (blodkär…

Discussion

De metoder och experimentella metoder som beskrivs här är ganska robusta och kan leda till tydliga och reproducerbara resultat när den tillämpas med stor omsorg om detaljerna. Bra elektrofysiologiska inspelningar och sammandragning / utvidgning av arteriella segment är beroende av hälsa celler och segment artär, respektive. Cellpreparationer kan variera från dag till dag, även med samma protokoll. Isolering lösningar kan användas i upp till 2 veckor, men om kvaliteten på cellpreparatet är låg på två påf…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S5886	Dissecting Solution: 145 Bath solution for Electrophysiology*: 140 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 140 Bath solution for pressure myography: 145 Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride	Sigma	P5405	Dissecting Solution: 4.7 Bath solution for Electrophysiology*: 5.36 Internal solution for electrophysiology: 135 Isolation solution for myocytes*: 5.36 Bath solution for pressure myography: 4.7 Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA	Sigma	E4378	Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES	Sigma	H9136	Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate	Sigma	S5136	Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate	Sigma	P5655	Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride	Sigma	M2393	Bath solution for Electrophysiology*: 1.2 Internal solution for electrophysiology: 1 Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride	Sigma	C7902	Bath solution for Electrophysiology*: 2 Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate	Fisher Scientific	BP331-1	Dissecting Solution: 1.2 Bath solution for pressure myography: 1.2 Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643	Dissecting Solution: 1.17 Bath solution for pressure myography: 1.17 Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	Dissecting Solution: 3 Bath solution for pressure myography: 3 Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid	Sigma	P4562	Dissecting Solution: 2 Bath solution for pressure myography: 2 Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate	Research Organics	9572E	Dissecting Solution: 0.02 Bath solution for pressure myography: 0.02 Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose	Sigma	G7021	Dissecting Solution: 5 Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 20 Isolation solution for myocytes*: 10 Bath solution for pressure myography: 5 Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin	Sigma	A3912	Dissecting Solution: 1% Lumen solution for pressure myography: 1%
pH			Dissecting Solution: 7.4 Bath solution for Electrophysiology*: 7.3 Internal solution for electrophysiology: 7.2 Isolation solution for myocytes*: 7.2 Bath solution for pressure myography: 7.4 Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity			Dissecting Solution: 300 Bath solution for Electrophysiology*: 298 Internal solution for electrophysiology: 298 Isolation solution for myocytes*: 298 Bath solution for pressure myography: 300 Lumen solution for pressure myography: 300
			*11
			Table 1. Components of solutions used in the experiment.