의 작성<em> Drosophila</em에 대한> 중부 뉴런<em> 현장에서</em> 패치 클램핑
Summary
현장 패치에 클램프 녹음은 그대로 회로의 뉴런의 electrophysiological 특성에 사용됩니다. CNS는 작고 강력한 피복에 둘러싸여 있기 때문에 Drosophila 유전자 모델 패치를 고정으로 어렵습니다. 이 문서는 이후의 패치 클램프 녹음의 집과 깨끗한 뉴런을 제거 할 수있는 절차에 대해 설명합니다.
Abstract
짧은 세대 시간 및 손쉬운 유전자 기술은 과일 파리 Drosophila melanogaster 기초 신경 과학 연구의 훌륭한 유전자 모델을 확인합니다. 그들은 neuronal 흥분을 중재 이후 이온 채널은 모든 행동의 기초입니다. 복제 제 1 전압 개폐 이온 채널은 Drosophila 전압 개폐 칼륨 채널 쉐이커 1,2했다. 신경계 기능에 대한 이온 채널과 막 흥분의 역할을 이해하는 방향으로는 현장 패치 클램프 녹음에서와 Drosophila에서 강력한 유전 도구를 사용할 수 결합 할 때 유용합니다. 수년 동안 이러한 녹음은 Drosophila의 CNS의 작은 크기에 방해되었습니다. 또한, glia 및 콜라겐으로 만든 강력한 집은 중앙 뉴런에 패치 피펫 액세스에 대한 장애물을 형성. 이 집의 제거는 성인 Drosophila의 CNS에서 뉴런의 패치 클램프 녹음에 필요한 전제 조건이다. 최근 몇 년과학자들은 성인 뇌 3,4 및 배아 5,6, 애벌레의 7,8,9,10, 그리고 성인 Drosophila 11,12,13,14의 복부 신경 코드를 뉴런에서 현장 패치 클램프 녹음에서 수행 할 수있었습니다. 안정적인 기가 – 씰은 좋은 패치의 주요 전제 조건이며, 누설 전류를 방지하기 위해 세포막과 패치 피펫의 깨끗한 접촉에 따라 달라집니다. 따라서 성인 Drosophila의 뉴런에서 현장 패치 클램프 녹음에서 전체 셀 철저하게 세척해야합니다. 첫 번째 단계에서, ganglionic 집은 효소 처리 할 수 있으며 기계적으로 대상 셀에 액세스 할 수 있도록하기 위해 제거. 두 번째 단계에서, 세포막은 glia, 콜라겐 또는 기타 자료의 어떤 항목은 기가 – 씰 형성을 방해하지 수 있도록 연마되어야한다. 이 문서는 체세포의 전체 C의 Drosophila 복부 신경 코드, 비행 motoneuron 5 (MN5 15)에서 확인 중앙 신경 세포를 준비하는 방법에 대해 설명합니다예쁜 패치 클램프 녹음. 신경 세포의 식별 및 가시성이 MN5에서 GFP의 대상 표현에 의해 달성된다. 우리는 패치 클램프 기술 자체를 설명하는 것을 목표로하지 않습니다.
Protocol
Discussion
GFP 같은 형광 단백질과 세포를 시각화 할 때, 너무 많은 빛에 준비를 과잉 노출하지 않는 것이 중요합니다. 이 사진 손상 될 수 있습니다. 우리는 조명을위한 100W HBO 짧은 아크 수은 전구를 사용하며, 우리는 또한 0.8 (채도 ND 필터 0.3과 0.5)의 중간 밀도 (ND)을 사용합니다. 청소 좋은 가시성의 품질을 판단 할 수 있도록하는 것은 매우 중요합니다. 따라서, ND 필터는 여러 번에 20 s의 짧은 기간 동?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agent/item | Company | Catalog number |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
| ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
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