تكرارية الأمثل من دوبلكسات DNA لبلورة-DNA من SeqA مجمعات
Summary
يمكن التركيب البلوري للبروتين DNA-المجمعات توفير نظرة ثاقبة وظيفة البروتين، وآلية، وكذلك، فإن طبيعة التفاعل محددة. هنا، ونحن التقرير كيفية تحسين طول، وينتهي تسلسل الحمض النووي دوبلكس للتبلور بالتعاون مع<em> كولاي</em> SeqA، منظم السلبية للبدء النسخ المتماثل.
Abstract
القولونية الإشريكية SeqA هو المنظم السلبية لتكرار الحمض النووي الذي يمنع المبكرة من الأحداث باستعادة مجموعات عزل GATC hemimethylated في الأصل من النسخ المتماثل 1. ما وراء الأصل، تم العثور على الشوك SeqA النسخ المتماثل، حيث تنظم DNA تكرارها حديثا في الهياكل العليا أمرت 2. SeqA الزميلة ضعيفة فقط مع تسلسل GATC واحدة، ولكنها تشكل مجمعات تقارب عالية مع الدوبلكس DNA التي تحتوي على مواقع متعددة GATC. الحد الأدنى من وحدة وظيفية وهيكلية من SeqA هو ديمر، موضحا بذلك الشرط ما لا يقل عن اثنين من سلاسل GATC لتشكيل مجمع عالية تقارب مع DNA hemimethylated 3. بالإضافة إلى ذلك، فإن هيكل SeqA، مع oligomerization وDNA ملزم المجالات مفصولة رابط مرنة، تسمح ملزمة ليكرر GATC مفصولة حتى يتحول حلزونية الثلاثة. لذلك، فهم وظيفة SeqA على المستوى الجزيئي يتطلب آنا الهيكليةتحلل من SeqA بد أن تسلسل GATC متعددة. في البروتين DNA التبلور، يمكن DNA لا شيء لتأثير استثنائي على التفاعلات التعبئة اعتمادا على الأحجام النسبية والهندسة المعمارية من البروتين والحمض النووي لل. إذا كان البروتين أكبر من DNA أو آثار أقدام معظم DNA، وتوسط في المقام الأول على التعبئة من الكريستال البروتين البروتين التفاعلات. وعلى العكس، عندما البروتين هو نفس الحجم أو أصغر من DNA أو أنه لا يغطي سوى جزء بسيط من التفاعلات DNA، والحمض النووي DNA-DNA والبروتين تهيمن التعبئة وضوح الشمس. ولذلك، بلورة البروتين DNA المجمعات يتطلب الفحص المنتظم من 4 طول DNA وينتهي DNA (كليلة أو عبء) 5-7. في هذا التقرير، ونحن تصف كيفية تصميم وتحسين وتنقية وبلورة دوبلكسات DNA hemimethylated تحتوي على جنبا إلى جنب يكرر GATC في مجمع مع متغير من مثنوي SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) للحصول على بلورات مناسبة لتحديد الهيكل.
Protocol
Discussion
واحدة من أكبر التحديات في البلورات بالأشعة السينية الجزيئات هو الحصول على بلورات نوعية حيود. في حالة المجمعات البروتين أو البروتين DNA، ويتفاقم هذا التحدي بسبب المتغيرات الإضافية التي يجب أن يكون الأمثل. ويعتقد على نطاق واسع أن طول DNA وجود يتدلى زجة لتعزيز رابطة الجوا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر موظفي PXRR في NSLS (بروكهافن المختبر الوطني) للحصول على المساعدة خلال جمع البيانات ومونيكا بيلون للمساعدة في تنقية DNA. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (MOP 67189).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments (optional) |
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
| Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
| Urea | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
| Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
| Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
| Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
| Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
| Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
| Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
| Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
| Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |
References
- Campbell, J. L., Kleckner, N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell. 62, 967-979 (1990).
- Guarné, A. Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization. Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).
- Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals. Science. 230, 1383-1385 (1985).
- Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization. J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).
- Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn. Cell. 87, 1295-1306 (1996).
- Yang, W., Steitz, T. A. Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site. Cell. 82, 193-207 (1995).
- Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).
- Timsit, Y., Moras, D. DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly. Embo J. 13, 2737-2746 (1994).
- Chung, Y. S., Guarne, A. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).
- DeLano, W. L. . The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).
