Iterative Optimering af DNA-duplekser for Krystallisation af SeqA-DNA-komplekser
Summary
Krystalstrukturen af protein-DNA-komplekser kan give indsigt i proteinfunktion, mekanisme, såvel som af arten af den specifikke interaktion. Her rapporterer vi hvordan man kan optimere længde, sekvens og ender duplex DNA for co-krystallisering med<em> Escherichia coli</em> SeqA, en negativ regulator af replikation indvielse.
Abstract
Escherichia coli SeqA er en negativ regulator af DNA-replikation, der forhindrer for tidlig reinitieringsaktivitet hændelser ved sekvestrering hemimethyleret GATC klynger i replikationsorigin 1. Ud over oprindelse, SeqA findes på replikationsgafler, hvor det organiserer nyligt replikeret DNA i højere ordnede strukturer 2. SeqA associerede kun svagt med enkelte GATC sekvenser, men danner høj affinitet komplekser med DNA-duplekser indeholder multiple GATC sites. Den minimale funktionel og strukturel enhed af SeqA er en dimer, hvilket forklarer kravet om mindst to GATC-sekvenser til dannelse af en høj-affinitet kompleks med hemimethyleret DNA 3. Derudover SeqA arkitektur med oligomerisering og DNA-bindende domæner adskilt af en fleksibel linker, tillader binding til GATC repeats er adskilt af op til tre spiralformede vindinger. Derfor forstå funktionen af SeqA på et molekylært niveau kræver strukturelle analysis af SeqA bundet til flere GATC-sekvenser. I protein-DNA krystallisation, kan DNA har ingen til en ekstraordinær effekt på emballagen interaktioner afhængig af de relative størrelser og arkitektur af proteinet og DNA. Hvis proteinet er større end DNA eller fodspor fleste af DNA'et, er krystallen emballagen primært medieret af protein-protein interaktioner. Omvendt, når proteinet er af samme størrelse eller mindre end DNA eller det kun omfatter en del af DNA, DNA-DNA og DNA-protein-interaktioner dominerer krystal pakning. Derfor krystallisation af protein-DNA-komplekser kræver systematisk screening af DNA længde 4 og DNA-ender (stump eller overhæng) 5-7. I denne rapport beskriver vi, hvordan man kan designe, optimere, rense og krystallisere hemimethyleret DNA-duplekser indeholdende tandem GATC repeats i kompleks med en dimer variant af SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) til opnåelse af krystaller er egnede til strukturbestemmelse.
Protocol
Discussion
En af de største udfordringer i makromolekylære røntgenkrystallografi er at få diffraktion kvalitet krystaller. I tilfælde af protein-eller protein-DNA-komplekser, er denne udfordring forværres på grund af de yderligere variabler, der skal optimeres. Det er en udbredt opfattelse, at længden af DNA'et og tilstedeværelsen af klæbrige overhangs at øge associeringen af tilstødende DNA-molekyler i en længere pseudo-duplex er de vigtigste parametre, der skal optimeres. Vi har imidlertid vist…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke PXRR personale på NSLS (Brookhaven National Laboratory) for assistance under dataindsamlingen og Monica Pillon for at få hjælp med DNA oprensning. Dette arbejde blev støttet af den canadiske Institutes of Health Research (MOP 67.189).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments (optional) |
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
| Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
| Urea | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
| Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
| Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
| Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
| Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
| Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
| Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
| Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
| Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |
References
- Campbell, J. L., Kleckner, N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell. 62, 967-979 (1990).
- Guarné, A. Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization. Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).
- Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals. Science. 230, 1383-1385 (1985).
- Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization. J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).
- Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn. Cell. 87, 1295-1306 (1996).
- Yang, W., Steitz, T. A. Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site. Cell. 82, 193-207 (1995).
- Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).
- Timsit, Y., Moras, D. DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly. Embo J. 13, 2737-2746 (1994).
- Chung, Y. S., Guarne, A. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).
- DeLano, W. L. . The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).
