Iterativ Optimering av DNA-duplex för Kristallisation av SeqA-DNA-komplex
Summary
Kristallstruktur av protein-DNA-komplex kan ge insikt i proteinfunktion, mekanism, liksom, arten av den specifika interaktionen. Här rapporterar vi hur du optimerar längden, sekvens och ändarna av duplex-DNA för samarbete kristallisation med<em> Escherichia coli</em> SeqA, en negativ regulator av replikering initiering.
Abstract
Escherichia coli SeqA är en negativ regulator av DNA-replikation som förhindrar för tidig förnyad initiering händelser genom att binda hemimetylerat GATC kluster inom replikationsursprung 1. Bortom ursprung, SeqA finns vid replikationsgafflar, där det anordnar nyligen replikerade DNA i högre beställda strukturer 2. SeqA associerar endast svagt med enstaka GATC-sekvenser, men den bildar hög affinitet komplex med DNA-duplexar som innehåller flera GATC platser. Den minimala funktionella och strukturella enheten av SeqA är en dimer, vilket förklarar kravet av minst två GATC-sekvenser för att bilda en hög affinitet komplex med hemimetylerat DNA 3. Dessutom tillåter SeqA arkitektur, med oligomerisering och DNA-bindande domänerna separerade av en flexibel linker, bindning till GATC upprepningar separerade med upp till tre spiralformade varv. Därför att förstå funktionen av SeqA på molekylär nivå kräver strukturella analys av SeqA bundet till flera GATC-sekvenser. I protein-DNA-kristallisering kan DNA har ingen en exceptionell effekt på förpackning interaktioner beroende på de relativa storlek och arkitektur av proteinet och DNA. Om proteinet är större än DNA eller fotavtryck flesta av DNA, är kristallen packningen primärt medieras av protein-protein-interaktioner. Omvänt, när proteinet är av samma storlek eller mindre än DNA eller det bara täcker en bråkdel av DNA, DNA-DNA och DNA-protein-interaktioner dominerar kristall packning. Därför kräver kristallisation av protein-DNA-komplex systematisk screening av DNA-längd 4 och slutar DNA (trubbig eller överhäng) 5-7. I denna rapport beskriver vi hur man designar, optimera, rena och kristallisera hemimetylerat DNA-duplex innehållande tandem GATC upprepningar i komplex med en dimer variant av SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) för att erhålla kristaller lämpliga för strukturbestämning.
Protocol
Discussion
En av de största utmaningarna i makromolekylär röntgenkristallografi är att få kristaller diffraktion kvalitet. I fallet med protein eller protein-DNA-komplex, är denna utmaning förvärras på grund av de ytterligare variabler som måste optimeras. Det anses allmänt att längden av DNA och närvaron av klibbiga överhäng för att öka associationen av angränsande DNA-molekyler i en längre pseudo-duplex är de viktigaste parametrarna för att optimera. Emellertid, har vi visat att naturen och längden på dess…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka PXRR personalen på NSLS (Brookhaven National Laboratory) för hjälp vid insamling av data och Monica Pillon för hjälp med DNA-rening. Detta arbete stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research (MOP 67.189).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments (optional) |
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
| Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
| Urea | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
| Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
| Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
| Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
| Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
| Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
| Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
| Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
| Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |
References
- Campbell, J. L., Kleckner, N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell. 62, 967-979 (1990).
- Guarné, A. Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization. Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).
- Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals. Science. 230, 1383-1385 (1985).
- Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization. J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).
- Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn. Cell. 87, 1295-1306 (1996).
- Yang, W., Steitz, T. A. Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site. Cell. 82, 193-207 (1995).
- Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).
- Timsit, Y., Moras, D. DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly. Embo J. 13, 2737-2746 (1994).
- Chung, Y. S., Guarne, A. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).
- DeLano, W. L. . The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).
