Techniek skeletspier weefsel van muizen myoblast progenitorcellen en toepassing van elektrische stimulatie
Summary
Engineered spierweefsel heeft een groot potentieel in de regeneratieve geneeskunde, als de ziekte model en ook als een alternatieve bron voor vlees. Hier beschrijven we de constructie van een spier construct, in dit geval van muis myoblast progenitor cellen en stimulering van elektrische pulsen.
Abstract
Ontworpen spierweefsel kan worden gebruikt voor verschillende doeleinden, waaronder de productie van weefsel voor gebruik als een ziektemodel in vitro, bijv. decubitus bestuderen voor regeneratieve geneeskunde en als vlees alternatief 1. De eerste melding 3D spier constructen zijn vele jaren geleden gemaakt en pioniers op het gebied zijn Vandenburgh en collega's 2,3. Vooruitgang in spierweefsel engineering zijn niet alleen het gevolg van de enorme winst in kennis van de biochemische factoren, stamcellen en progenitorcellen, maar zijn met name gebaseerd op inzichten die door de onderzoekers dat de fysieke factoren een essentiële rol in de controle van cel gedrag spelen en weefsel ontwikkeling. State-of-the-art ontworpen spier bouwt bestaan momenteel uit cel-bevolkte hydrogel constructen. In ons lab deze over het algemeen bestaan uit murine myoblast progenitorcellen, geïsoleerd uit muizen achterste ledematen spieren of een muizen myoblast cellijn C2C12, mixed met een mengsel van collageen / Matrigel en uitgeplaat tussen twee ankerpunten, nabootsen van de spier ligamenten. Andere cellen kunnen eveneens worden overwogen, bijvoorbeeld alternatieve cellijnen zoals L6 myoblasten rat 4 neonatale spier afgeleide progenitorcellen 5, cellen afkomstig van volwassen spierweefsel van andere species zoals humaan 6 of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS cellen) 7 . Cell contractiliteit veroorzaakt uitlijning van de cellen langs de lengteas van de construct 8,9 en differentiatie van de spier progenitorcellen na ongeveer een week van cultuur. Bovendien is de toepassing van elektrische stimulatie kan de differentiatie verbeteren enigszins 8. Vanwege de beperkte omvang (8 x 2 x 0,5 mm) het volledige weefsel kan worden geanalyseerd met behulp van confocale microscopie zoals levensvatbaarheid, differentiatie en celuitlijning controleren. Afhankelijk van de specifieke toepassing van voorschriften voor de engineerood spierweefsel variëren, bijvoorbeeld bij gebruik voor regeneratieve geneeskunde is het opschalen van weefsel grootte en vascularisatie, terwijl om als vleesvariatie vertaling naar andere soorten noodzakelijk.
Protocol
Representative Results
Discussion
De engineering van spierweefsel heeft een groot potentieel voor het gebruik als een ziekte model, voor drug discovery, in de regeneratieve geneeskunde en voor de vleesproductie. Echter, de eisen voor deze toepassingen variëren. We kozen voor werken met een combinatie van collageen en Matrigel, omdat collageen maakt celuitlijning en omdat de myoblast progenitor cellen vereisen de aanwezigheid van basale membraan eiwitten afkomstig zoals bepaald in eerdere studies 2D 12. Bovendien zijn fibrinegelen getest in o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Yabin Wu bedanken voor het kweken van de weefsels die in figuur 2, werd de foto genomen door Bart van Overbeeke. Het werk werd financieel ondersteund door SenterNovem, subsidie ISO 42022.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 – 1,1 mm | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 – 1,6 mm | |
| Pasteur pipette | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
References
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
