Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation
Summary
Engineered Muskelgewebe hat ein großes Potenzial in der regenerativen Medizin, als Krankheit Modell und auch als alternative Quelle für Fleisch. Hier beschreiben wir die Konstruktion von einem Muskel-Konstrukt, in diesem Fall von der Maus Myoblasten Vorläuferzellen, und die Stimulation durch elektrische Impulse.
Abstract
Engineered Muskelgewebe kann für verschiedene Zwecke verwendet werden, die die Produktion von Geweben für den Einsatz als eine Krankheit Modell in vitro, zB um Druckgeschwüre zu studieren, für die regenerative Medizin und als Fleisch Alternative 1. Die erste gemeldete 3D Muskel-Konstrukte wurden vor vielen Jahren und machte Pioniere auf dem Gebiet sind Vandenburgh und Kollegen 2,3. Advances in Muskelgewebe Technik gemacht sind nicht nur das Ergebnis aus dem großen Gewinn an Wissen über biochemische Faktoren, Stammzellen und Vorläuferzellen, sondern sind insbesondere auf der Basis von Erkenntnissen von Forschern gewonnen, dass physische Faktoren eine essentielle Rolle bei der Kontrolle von Verhalten der Zelle spielen und Gewebe Entwicklung. State-of-the-art engineered Muskel baut derzeit von Zell-besiedelten Hydrogel Konstrukten bestehen. In unserem Labor diese in der Regel aus murine Myoblasten Vorläuferzellen, aus murinen Hinterbein Muskeln isoliert oder einem murinen Myoblasten-Zelllinie C2C12, mixed mit einer Mischung aus Kollagen / Matrigel und ausplattiert zwischen zwei Verankerungspunkten, imitiert die Muskel Bänder. Andere Zellen können ebenfalls berücksichtigt werden, z. B. alternative Zelllinien wie L6 Ratte Myoblasten 4, neonataler Muskel abgeleitet Vorläuferzellen 5, aus adulten Muskelgewebe aus anderen Spezies, wie Mensch 6 oder sogar induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) 7 abgeleitete . Zellkontraktilität bewirkt Ausrichtung der Zellen entlang der langen Achse des Konstrukts 8,9 und Differenzierung der Muskel-Vorläuferzellen nach etwa einer Woche der Kultur. Außerdem kann die Anwendung der elektrischen Stimulation des Prozesses der Differenzierung teilweise 8 verbessern. Aufgrund seiner geringen Größe (8 x 2 x 0,5 mm) das komplette Gewebe analysiert mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie zB Rentabilität, Differenzierung und Ausrichtung der Zellen zu überwachen. Abhängig von der spezifischen Anwendung der Bedingungen für die engineered Muskelgewebe variieren, z. B. Einsatz für die regenerative Medizin erfordert die Upscaling von Gewebe Größe und Vaskularisation, während als ein Fleisch alternative Übersetzung in andere Arten ist notwendig, zu dienen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Engineering von Muskelgewebe hat ein großes Potenzial für den Einsatz als eine Krankheit Modell für Wirkstoff-Screening, in der regenerativen Medizin und für die Fleischproduktion. Allerdings unterscheiden sich die Anforderungen für diese Anwendungen. Wir entschieden uns, mit einer Kombination aus Collagen und Matrigel arbeiten, weil Kollagen ermöglicht Zellausrichtung und weil die Myoblasten Vorläuferzellen erfordern das Vorhandensein von Basalmembran abgeleitete Proteine wie in früheren Studien 2D <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren wollen Yabin Wu für die Kultivierung der Gewebe in Abbildung 2 dargestellt danken, wurde das Bild von Bart van Overbeeke genommen. Die Arbeit wurde finanziell unterstützt durch SenterNovem, Gewährung ISO 42022 unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 – 1,1 mm | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 – 1,6 mm | |
| Pasteur pipette | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
References
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