רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי
Summary
רקמת שריר מהונדסת יש פוטנציאל גדול ברפואת רגנרטיבית, כמודל מחלה וגם כמקור חלופי לבשר. כאן אנו מתארים ההנדסיים של מבנה שרירים, במקרה זה מתאי עכבר והיצמדות לאב, והגירוי על ידי פולסים חשמליים.
Abstract
רקמות שריר מהונדס יכולות לשמש למספר מטרות שונות, הכוללת את הייצור של רקמות לשימוש כמודל מחלה במבחנה, למשל ללמוד כיבי לחץ, ולרפואת רגנרטיבית כחלופת בשר 1. מבני השרירים הראשונים שדווחו 3D נעשו לפני שנים רבות וחלוץ בתחום הם Vandenburgh ועמיתי 2,3. שיפורים שנעשה בהנדסת רקמת שריר הם לא רק תוצאה מהעלייה העצומה בידע של גורמים ביוכימיים, תאי גזע ותאי אב, אבל הם במבוססים בעיקר על תובנה שנרכשו על ידי חוקרים כי גורמים פיסיים משחקים תפקיד חיוני בשליטה על התנהגות תא ו רקמת פיתוח. שריר מהונדס מדינה-of-the-art בונה כיום מורכב ממבנים הידרוג תא מאוכלסים. במעבדה שלנו אלה בדרך כלל מורכבים מתאי Murine היצמדות progenitor, מבודדים מרירי גפיים אחוריים Murine או קו תא היצמדות עכברי C2C12, mixed בתערובת של קולגן / Matrigel ומצופה בין שתי נקודתי עיגון, מחק את רצועות השריר. תאים אחרים עשויים להיחשב גם כן, שורות תאים חלופיות כגון כגון L6 myoblasts חולדה 4, תאי שריר הילוד נגזרים progenitor 5, תאים שמקורם ברקמות שריר בוגרים ממינים אחרים, כגון אדם או 6 תאי גזע pluripotent מושרים אפילו (תאי iPS) 7 . contractility הסלולרי גורם ליישור של התאים לאורך הציר הארוך של מבנה 8,9 וההתמיינות של תאי אב השריר לאחר כשבוע של התרבות. יתר על כן, היישום של גירוי חשמלי יכול לשפר את התהליך של התמיינות במידה מסוימת 8. בגלל גודלו המוגבל (8 X 2 X 0.5 מ"מ) רקמה המלאה ניתן לנתח באמצעות מיקרוסקופיה confocal לפקח כדאיות למשל, בידול ויישור תא. בהתאם ליישום הספציפי בדרישות לעבודות ההנדסהרקמת שריר אדומה תשתנה; שימוש דוגמה לרפואת רגנרטיבית דורש גמלון גודל רקמות וכלי הדם, ואילו לשמש כחלופת תרגום בשר למינים אחרים הוא הכרחי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנדסת רקמות שריר יש פוטנציאל גדול לשימוש כמודל מחלה, לסריקת תרופות וברפואת רגנרטיבית לייצור בשר. עם זאת, הדרישות ליישומים אלה משתנות. אנחנו בחרנו לעבוד עם שילוב של קולגן וmatrigel, כי קולגן מאפשר יישור תאים וכי תאי אב ההיצמדות דורשים נוכחות של חלבונים שמקורם בממברנה מרתף…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לYabin וו עבור culturing הרקמות המוצגות באיור 2, התמונה צולמה על ידי ברט ואן Overbeeke. העבודה נתמכת כלכלית על ידי SenterNovem, המענק 42022 ISO.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 – 1,1 mm | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 – 1,6 mm | |
| Pasteur pipette | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
References
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
