3-dimensionelt Resin Støbning og Imaging of Mouse Portal Vein eller Intrahepatisk galdegang System
Summary
En fremgangsmåde til visualisering og kvantificering af 3-dimensionale struktur af muse portårevenen eller intrahepatisk galdegang er beskrevet. Denne harpiks støbt teknik kan også anvendes på andre duktale eller vaskulære systemer og muliggør<em> In situ</em> Visualisering eller kvantificering af et systems intakt kommunikere arkitektur.
Abstract
I organer, er den korrekte arkitektur af vaskulære og ductal strukturer uundværlig for korrekt fysiologisk funktion, og dannelsen og vedligeholdelsen af disse strukturer er en stærkt reguleret proces. Analysen af disse komplekse, tre-dimensionelle strukturer er i høj grad afhængig af enten 2-dimensional behandling i snit eller på farvning injektion undersøgelser. Disse teknikker er imidlertid ikke i stand til at give et komplet og kvantificerbar repræsentation af de duktale eller vaskulære strukturer de skal belyse. Alternativt arten af 3-dimensionale plastharpiks afstøbninger frembringer en permanent øjebliksbillede af systemet og er et hidtil ukendt og meget nyttig teknik til visualisering og kvantificering af 3-dimensionelle strukturer og netværk.
En afgørende fordel ved harpiksens støbning systemet er evnen til at bestemme den intakte og forbundet, eller kommunikere, strukturen af et blodkar eller kanal. Strukturen af vaskulære og duclæggende net er afgørende for organfunktion, og denne teknik har potentiale til at støtte undersøgelse af vaskulære og ductal net på flere måder. Harpiks støbning kan anvendes til at analysere normal morfologi og funktionelle arkitektur af en luminal struktur, identificere udviklingsmæssige morfogenetiske ændringer og afdække morfologiske forskelle i vævsarkitektur mellem normale og sygdomstilstande. Tidligere arbejde har udnyttet harpiks støbning for at studere, for eksempel, arkitektoniske og funktionelle defekter i mus intrahepatisk galde kanalsystem, som ikke var afspejlet i 2-dimensional analyse af strukturen 1,2, ændringer i hjernen vaskulaturen af en Alzheimers sygdom musemodel 3 , vena abnormiteter i portal hypertensive og cirrotiske mus 4, udviklingsmæssige skridt i rotte lymfatisk modning mellem umodne og voksne lunger 5, umiddelbare mikrovaskulære ændringer i rotte lever, bugspytkirtel og nyre som respons på til kemisk skade6.
Her præsenterer vi en metode til at generere en 3-dimensionel harpiks støbt af en mus vaskulær eller ductal netværk, der fokuserer specifikt på portalen vene og intrahepatisk galdegang. Disse afstøbninger kan visualiseres ved at fjerne eller udblødning af væv og kan derefter analyseres. Denne teknik kan anvendes til stort set alle vaskulære eller gangsystemet og ville være direkte anvendelse på enhver undersøgelse spørgende i udvikling, funktion, vedligeholdelse eller skade af en 3-dimensionel ductal eller vaskulær struktur.
Protocol
Discussion
Vi har beskrevet specifikke eksempler på, hvordan portvenen og intrahepatiske galdegangsceller systemer i leveren kan støbes, men denne teknik kan anvendes på praktisk talt alle andre ductal eller vaskulære system med små justeringer. Tidligere arbejde har påvist gennemførligheden af denne teknik i flere arter, herunder mus 1,2,7-9, ælling 10,11, kanin 12,13, hund 14 og svin 15, og i mange organer, herunder nasal kirtel 14, hjertet 16, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH) til SSH (R01-DK078640), fra Howard Hughes Medical Institute (HHMI) gennem HHMI / Vanderbilt University Certificate Program i molekylær medicin til TJW (GRDOT56006779), den Vanderbilt Diabetes Research and Training Center (P30-DK020593) og Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30-DK058404) at yde Core Services.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog number | Comments |
| PE10 polyethylene tubing | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 surgical black braided silk | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm needle | Air-tite | TSK3213 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Mercox II kit | Ladd Research | 21247 | |
| Benzyl alcohol | Fisher Scientific | 1816-04 | Only required for BABB-clearing |
| Benzyl benzoate | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Only required for BABB-clearing |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Modeling clay | |||
| Scale | |||
| Laboratory scissors | |||
| 15 ml cap polypropylene tubes | |||
| 4% paraformaldahyde | |||
| 15% potassium hydroxide (KOH) | Only required for maceration | ||
| Razor blade | |||
| 100% methanol | |||
| 3 ml luer lock syringe |
References
- Sparks, E. E., Perrien, D. S., Huppert, K. A., Peterson, T. E., Huppert, S. S. Defects in hepatic Notch signaling result in disruption of the communicating intrahepatic bile duct network in mice. Dis. Model Mech. 4, 359-367 (2011).
- Vanderpool, C. Genetic interactions between hepatocyte nuclear factor-6 and notch signaling regulate mouse intrahepatic bile duct development in vivo. Hepatology. 55, 233-243 (2012).
- Meyer, E. P., Ulmann-Schuler, A., Staufenbiel, M., Krucker, T. Altered morphology and 3D architecture of brain vasculature in a mouse model for Alzheimer’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 3587-3592 (2008).
- Van Steenkiste, C. Vascular corrosion casting: analyzing wall shear stress in the portal vein and vascular abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic rodents. Lab Invest. 90, 1558-1572 (2010).
- Dickie, R., Cormack, M., Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Tsuda, A. Deep pulmonary lymphatics in immature lungs. Journal of Applied Physiology. 107, 859-863 (2009).
- Kelly, D. M., McEntee, G. P., McGeenery, K. F., Fitzpatrick, J. M. Microvasculature of the pancreas, liver, and kidney in cerulein-induced pancreatitis. Archives of Surgery. 128, 293-295 (1993).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Carlson, T. R. Endothelial expression of constitutively active Notch4 elicits reversible arteriovenous malformations in adult mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9884-9889 (2005).
- Hemmeryckx, B., Emmerechts, J., Bovill, E. G., Hoylaerts, M. F., Lijnen, H. R. Effect of ageing on the murine venous circulation. Histochem. Cell Biol. , (2012).
- Hossler, F. E., Olson, K. R. Microvasculature of the nasal salt gland of the duckling, Anas platyrhynchos: quantitative responses to osmotic adaptation and deadaptation studied with vascular corrosion casting. J. Exp. Zool. 254, 237-247 (1990).
- Hossler, F. E., West, R. F. Venous valve anatomy and morphometry: studies on the duckling using vascular corrosion casting. Am. J. Anat. 181, 425-432 (1988).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Structure and blood supply of intrinsic lymph nodes in the wall of the rabbit urinary bladder–studies with light microscopy, electron microscopy, and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 477-484 (1998).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Evidence for a unique elastic sheath surrounding the vesicular arteries of the rabbit urinary bladder–studies of the microvasculature with microscopy and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 472-476 (1998).
- Hossler, F. E., Kao, R. L. Microvasculature of the urinary bladder of the dog: a study using vascular corrosion casting. Microsc. Microanal. 13, 220-227 (2007).
- Wischgoll, T., Choy, J. S., Kassab, G. S. Extraction of morphometry and branching angles of porcine coronary arterial tree from CT images. Am J Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1949-H1955 (2009).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E., Douglas, L. E. Anatomy and morphometry of myocardial capillaries studied with vascular corrosion casting and scanning electron microscopy: a method for rat heart. Scan Electron Microsc. , 1469-1475 (1986).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E. Vascular Corrosion Casting: Review of Advantages and Limitations in the Application of Some Simple Quantitative Methods. Microsc. Microanal. 7, 253-264 (2001).
- Mondy, W. L. Micro-CT of corrosion casts for use in the computer-aided design of microvasculature. Tissue Eng. Part C Methods. 15, 729-738 (2009).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative Assessment of the Rat Intrahepatic Biliary System by Three-Dimensional Reconstruction. The American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic Artery and Portal Vein Remodeling in Rat Liver: Vascular Response to Selective Cholangiocyte Proliferation. The American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
