السلف المستمدة من نظام الثقافة دبقية قليلة التغصن من دماغ الجنين البشري

Summary

الأولية، والإنسان الجنين الدماغ المستمدة، تتكاثر الخلايا الاصلية multipotential<em> في المختبر</em> مع الحفاظ على القدرة على التمايز إلى خلايا عصبية والخلايا النجمية. هذا العمل يدل على أن يمكن أن يتسبب الأسلاف العصبية للتميز من خلال مراحل النسب oligodendrocytic من تكييف عوامل النمو مختارة.

Abstract

التفريق بين الأسلاف العصبية الإنسان في أنواع الخلايا العصبية والدبقية تقدم نموذجا للدراسة والمقارنة بينها تنظيم الخلية العصبية الجزيئية للتنمية النسب. في توسيع المختبر من الأسلاف العصبية من الأنسجة الجنينية CNS اتسمت أيضا. على الرغم من تحديد وعزل الأسلاف الدبقية من الكبار المسألة الفرعية القشرية الإنسان الأبيض وتطور الأوضاع المختلفة لثقافة التمييز المباشر من الأسلاف العصبية الجنينية في إنتاج oligodendrocytes قد المايلين، والحصول على oligodendrocytes قد البشرية الكافية لفي المختبر التجريب لا يزال صعبا. التفريق بين غالاكتوسيريبروزيد ⁺ (GalC) وO4 ⁺ تم الإبلاغ عن السلائف دبقية قليلة التغصن أو الخلايا الاصلية (OPC) من الخلايا العصبية باستخدام السلائف 2 الثلث الدماغ الجنين. ومع ذلك، فإن هذه الخلايا لا تتكاثر في غياب الخلايا النجمية بما في ذلك دعم والخلايا العصبية، وسرعان ما فقدت مع مرور الوقت في الثقافة. لا تزال الحاجة لنظام الثقافة لإنتاج خلايا دبقية قليلة التغصن من سلالة مناسبة لفي التجريب المختبر.

يمكن أن ثقافة الإنسان oligodendrocytes قد الابتدائي، على سبيل المثال، تكون نموذجا مفيدا لدراسة العوامل المعدية التسبب في الموجهات العصبية مثل الفيروسة التورامية الإنسان، JCV، في الجسم الحي أن يصيب تلك الخلايا. يمكن لهذه الخلايا المستزرعة توفر أيضا نماذج من الأمراض الأخرى المزيل من الجهاز العصبي المركزي (CNS). الأولية، والجنين البشري الدماغ المستمدة، multipotential تتكاثر الخلايا الاصلية العصبية في المختبر مع الحفاظ على القدرة على التمايز إلى خلايا عصبية (عصبونات السلف المستمدة، PDN) والخلايا النجمية (المشتقة من الخلايا النجمية السلف، PDA) تظهر هذه الدراسة أن يمكن أن يتسبب الأسلاف العصبية للتميز من خلال العديد من مراحل التنمية النسب oligodendrocytic (السلف المستمدة من oligodendrocytes قد، PDO). نحن الخلايا العصبية الثقافة السلف في وسائل الإعلام المصل خالية DMEM-F12 سوبplemented مع عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، الصفائح الدموية المستمدة عامل النمو (PDGF-AA)، القنفذ الصوتي (SHH)، وعامل التغذية العصبية 3 (NT-3)، N-2 و triiodothyronine (T3). وpassaged في الخلايا المستزرعة في خلايا 2.5e6 في قوارير 75CM تقريبا كل سبعة أيام. باستخدام هذه الشروط، فإن غالبية الخلايا في الثقافة حفاظ على مورفولوجيا تتميز بعض العمليات وعلامات صريحة من قبل خلايا دبقية قليلة التغصن، مثل A2B5 وO-4. عندما كنا إزالة عوامل النمو الأربعة (GF) (bFGF، PDGF-AA، SHH، NT-3) وإضافة وسائط مكيفة من PDN، تبدأ الخلايا للحصول على مزيد من العمليات وعلامات صريحة محددة من التمايز دبقية قليلة التغصن، مثل GalC والمايلين الأساسية البروتين (MBP). أجرينا توصيف المظهري باستخدام متعدد الألوان التدفق الخلوي لتحديد علامات فريدة من دبقية قليلة التغصن.

Protocol

ملاحظة: للحصول على زراعة الروتيني للسلف العصبية والخلايا النسب oligodendrocytic، ويتم حضانة في 37 ° C في مرطب الجو 2 5٪ CO. كل يوم 2، يتم استبدال المتوسطة باستخدام 50 إلى 100٪ من متوسط ​​جديدة اذا الثقافة هي متموجة 40-70٪. في وقت confluency القريب، وpassaged الثقافات في قارورة 2-…

Representative Results

من المهم جدا لبدء عملية التمايز من -80٪ 70٪ متموجة العصبية السلف زراعة الخلايا (الشكل 1A). سوف تنقرض العديد من الخلايا بعد تغيير ثقافة المتوسط ​​من السلف والمتوسطة بنسبة ضئيلة نظرا لأنه يتضمن عوامل نمو محددة. هذا يدل على أن لن نمو الخلايا العصبية السلف لم يرتكب …

Discussion

هذا البروتوكول يصف كيفية اشتقاق oligodendrocytes قد الجنين من المرحلة الابتدائية خلايا العصبية السلف وتميز النمط الظاهري وذلك باستخدام كل من التدفق الخلوي المناعي وتلطيخ. وقد تم توسيع ونمو الأسلاف العصبية من الجهاز العصبي المركزي الجنين بشكل جيد للغاية ووصف ^1-4. ومع ذ?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Final concentration
DME/HAMS F12 1:1	Omega Scientist	DM-251	1X
Bovine Albumin	Sigma	A9418	1%
Gentamicin	Quality Biologicals	120-098-031	50 μg/ml
L-Glutamine	Quality Biologicals	118-084-061	2 mM
T3	Sigma	T2877	3 nM
N2 Components	Gibco BRL	17502	1:100
NT-3	PeproTech Inc	450-03	2 ng/ml
Shh	R&D System	1314-SH/CF	2 ng/ml
bFGF	PeproTech Inc	100-18B	20 ng/ml
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	10 ng/ml
PDL	Sigma	P6407	50 μg/m
PFA	Electron Microscopy Sciences	15712	2%
Trypsin	Quality Biologicals	118-087-721
Papain	Worthington	LK003178	20 U/ml
DNase vials	Worthington	LK003172	0.005%
EBSS	Worthington	LK003188
ProLong Gold with DAPI	Invitrogen	P36931
			Table 1. Reagents.
			Primary Abs(all at 1 μg/ml) Species Isotype Source Secondary Abs Flow Cytometry A2B5-Biotin Mouse IgM Gift J. Nielson Streptavidin PETR, Invitrogen, CA O4FITC Mouse IgM Gift from J. Nielson A2B5 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA O4 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA GalC Mouse IgG3 Millipore, MA gαm IgG3-PE, Southern Biotech, AL MBP Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA Nestin Mouse IgG1 Messam et al. 200028 gαm IgG1-PECy5, Invitrogen, CA GFAP Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA βIII tubulin Mouse IgG2 Covance, CA gαm IgG2a-PETR, Invitrogen, CA Immunocytochemistry βIII tubulin (1:1,500) Mouse IgG2a Covance, CA gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) GFAP (1:1,000) Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA (1:500) MBP (1:50) Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA (1:100) O4 (1:100) Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1:100) GalC (1:10) Rabbit IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken.