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신경과학

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템

Published: December 20, 2012
doi:
10.3791/4274
, , , , ,
1Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience,National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Neurophysiology,National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 전구 세포는 세포 분열 따위에 의해 번식<em> 체외에서</em> 뉴런과 astrocytes로 차별화 할 수있는 능력을 유지하면서. 이 작품은 신경 progenitors은 선택의 성장 요인과 에어컨하여 oligodendrocytic 계보 (Lineage)의 단계를 통해 차별화하도록 유도 될 수 것으로 나타났습니다.

Abstract

neuronal와 glial 세포 유형으로 인간의 신경 progenitors의 차별화 신경 세포 계보 (Lineage) 개발의 분자 규정을 연구하고 비교하는 모델을 제공합니다. 태아 CNS 조직에서 신경 progenitors의 체외 확장에 잘 특징되었습니다. 체외 실험에서 충분한 인간의 oligodendrocytes을 획득 myelin 생산 oligodendrocytes에 태아 신경 progenitors의 직접 분화에 다양한 문화 조건 성인의 하위 대뇌 피질의 흰색 물질과 개발에서 glial progenitors의 식별 및 격리에도 불구하고 어려운 남아있다. galactocerebroside + (GalC)와 O4의 차별화가 + oligodendrocyte 전구체 또는 신경 전구체 세포의 전구 세포는 (OPC) 둘째 임신 태아 뇌를 사용하는 것으로보고되었습니다. 그러나, 이러한 전지는 astrocytes 뉴런 등의 지원 세포의 부재에서 세포 분열 따위에 의해 번식하지 않으며, 문화에 시간이 지남에 따라 빠르게 사라집니다. 필요가 체외 실험에서 적합 oligodendrocyte 혈통의 세포를 생산하는 문화 시스템 남아 있습니다.

기본 인간 oligodendrocytes의 문화 예를 들어, 생체에 그 세포를 감염 인간의 polyomavirus, JCV 같은 neurotropic 전염성 대리인의 pathogenesis을 연구 할 수있는 유용한 모델이 될 수 있습니다. 이러한 배양 세포는 중추 신경계 (CNS)의 다른 demyelinating 질병의 모델을 제공 할 수 있습니다. 뉴런 (전구 – 파생 뉴런, PDN)와 astrocytes (전구 파생 astrocytes, PDA)이 연구는 신경 progenitors을 유도 할 수 있다는 표시로 차별화 할 수있는 능력을 유지하면서 기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 신경 전구 세포는 체외에서 세포 분열 따위에 의해 번식 oligodendrocytic 계보 (Lineage) 개발의 단계 (전구 파생 oligodendrocytes, PDO)의 많은을 통해 차별화합니다. DMEM-F12 혈청이없는 미디어의 우리 문화 신경 전구 세포는 저녁을 먹다기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-AA), 소닉 고슴도치 (쉬), neurotrophic 요인 3 (NT-3), N-2 및 triiodothyronine (T3)로 plemented. 배양 세포는 대략 칠일 75cm 플라스크 당 2.5e6 세포에 passaged 있습니다. 이러한 조건에 사용 문화의 세포의 대부분이 몇 프로세스 및 A2B5 및 O-4 같은 사전 oligodendrocyte 세포의 명시 적 마커 특징으로 형태를 유지하고 있습니다. 우리가 네 가지 성장 요인 (GF) (bFGF, P​​DGF-AA, 쉬, NT-3)을 제거하고 PDN에서 설치된 미디어를 추가하면 세포는 GalC 및 myelin 등 oligodendrocyte 차별화의 특정 더 많은 프로세스와 명시 적 마커를 획득하기 시작 기본 단백질 (MBP). 우리는 oligodendrocyte의 독특한 마커를 식별 할 수 다색의 유동 세포 계측법을 사용하여 phenotypic 특성을 선보였습니다.

Protocol

참고 : 신경 전구와 oligodendrocytic 계보 (Lineage) 세포의 일상 배양를 들어, 부화는 37 번 ° C humidified 5 % CO 2 분위기에서 이루어집니다. 모든 2 일, 매체는 문화가 40~70%의 합류 경우 신선한 매체의 50~100%를 사용하여 대체됩니다. 근처 confluency의 시간에서, 문화는 보통 주간 일정에 2-2.5e6/T75 플라스크에 passaged 있습니다. 1. 코팅 휴대용 술병을 준비 코팅 ?…

Representative Results

이 70 % -80 % 합류 신경 전구 세포 배양 (그림 1A)에서 차별화 프로세스를 시작하는 것은 매우 중요합니다. 많은 세포는 특정 성장 요인을 포함 있기 때문에 전구에서 oligo 매체에 문화 매체를 변경 한 후에는 죽을 것이다. 이 oligodendrocytic 표현형에 커밋되지 신경 전구 세포의 성장이 새로운 매체 (그림 1b)에 의해 지원되지 않습니다 나타냅니다. 일주일 동안 oligo 중간 + GF의 ?…

Discussion

이 프로토콜은 기본 인간 신경 전구 세포에서 태아 oligodendrocytes을 유도하고 유동 세포 계측법과 immunofluorescence 얼룩을 모두 사용하여 표현형을 특징하는 방법에 대해 설명합니다. 태아 CNS에서 신경 progenitors의 확장과 성장은 잘 1-4에 설명되어 있습니다. 이 성인의 흰색 물질 5-13에서 glial 전구체를 식별하고 분리 할 수 있습니다에도 불구 그러나, 체외 실험에서 충분한 인간?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 국립 보건원, NINDS의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다. 저자는 편집을 돕기 위해 현미경과 파멜라 C.의 체질을 돕기 위해 분자 의학 및 신경 과학, 릭 Dreyfuss의 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Final concentration
DME/HAMS F12 1:1 Omega Scientist DM-251 1X
Bovine Albumin Sigma A9418 1%
Gentamicin Quality Biologicals 120-098-031 50 μg/ml
L-Glutamine Quality Biologicals 118-084-061 2 mM
T3 Sigma T2877 3 nM
N2 Components Gibco BRL 17502 1:100
NT-3 PeproTech Inc 450-03 2 ng/ml
Shh R&D System 1314-SH/CF 2 ng/ml
bFGF PeproTech Inc 100-18B 20 ng/ml
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 10 ng/ml
PDL Sigma P6407 50 μg/m
PFA Electron Microscopy Sciences 15712 2%
Trypsin Quality Biologicals 118-087-721
Papain Worthington LK003178 20 U/ml
DNase vials Worthington LK003172 0.005%
EBSS Worthington LK003188
ProLong Gold
with DAPI		 Invitrogen P36931

Table 1. Reagents.
Primary Abs(all at 1 μg/ml) Species Isotype Source Secondary Abs
Flow Cytometry
A2B5-Biotin Mouse IgM Gift J. Nielson Streptavidin PETR, Invitrogen, CA
O4FITC Mouse IgM Gift from J. Nielson
A2B5 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
O4 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
GalC Mouse IgG3 Millipore, MA gαm IgG3-PE, Southern Biotech, AL
MBP Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA
Nestin Mouse IgG1 Messam et al. 200028 gαm IgG1-PECy5, Invitrogen, CA
GFAP Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA
βIII tubulin Mouse IgG2 Covance, CA gαm IgG2a-PETR, Invitrogen, CA
Immunocytochemistry
βIII tubulin
(1:1,500) 		Mouse IgG2a Covance, CA gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA
(1:1,000)
GFAP
(1:1,000) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA
(1:500)
MBP
(1:50)		 Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA
(1:100)
O4
(1:100) 		Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA
(1:100)
GalC
(1:10) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA
(1:100)

Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken.
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References

  1. Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
  2. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  3. Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
  4. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
  5. Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
  6. Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
  7. Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
  8. Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
  9. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
  10. Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
  11. Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
  12. Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
  13. Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
  14. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  15. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
  16. Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
  17. Gard, A. L., Williams, W. C., Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
  18. Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
  19. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  20. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
  21. Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
  22. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
  23. Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
  24. Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
  25. Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
  26. D’Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
  27. Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
  28. Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).

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Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture SystemHuman Fetal BrainDifferentiationNeural ProgenitorsNeuronal Cell TypesGlial Cell TypesMolecular RegulationNeural Cell Lineage DevelopmentIn Vitro ExpansionGlial ProgenitorsSub-cortical White MatterCulture ConditionsMyelin Producing OligodendrocytesGalactocerebroside+O4+ Oligodendrocyte Precursor Or Progenitor Cells (OPC)Neural Precursor CellsSupport Cells (astrocytes And Neurons)Culture SystemIn Vitro ExperimentationPrimary Human OligodendrocytesPathogenesisNeurotropic Infectious Agents (human PolyomavirusJCV)Demyelinating DiseasesCentral Nervous System (CNS)
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Monaco, M. C. G., Maric, D., Bandeian, A., Leibovitch, E., Yang, W., Major, E. O. Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain. J. Vis. Exp. (70), e4274, doi:10.3791/4274 (2012).
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