كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية
Summary
نحن تصف طريقة الكهروكيميائية فحص جهاز استشعار للكشف عن بكتيريا السريع وتحديد الهوية. الفحص ينطوي على مجموعة أجهزة الاستشعار functionalized مع الحمض النووي قليل النوكليوتيد تحقيقات لالتقاط الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) تسلسل أنواع محددة. تهجين شطيرة من الريباسي الهدف مع التحقيق القبض على والفجل البيروكسيداز المرتبطة الحمض النووي للكشف عن قليل النوكليوتيد التحقيق تنتج تيارا تجاه المؤثرات الخارجية قابلة للقياس.
Abstract
وتستخدم أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية على نطاق واسع لقياس سريع ودقيق من السكر في الدم ويمكن تكييفها للكشف عن مجموعة واسعة من التحاليل. أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية تعمل عن طريق transducing حدثا الاعتراف البيولوجية إلى إشارة كهربائية مفيدة. يحدث نقل الإشارة من قبل اقتران نشاط انزيم الأكسدة والاختزال إلى القطب تجاه المؤثرات الخارجية. خصوصية استشعار إما سمة ملازمة للانزيم، أوكسيديز الجلوكوز في حالة وجود جهاز استشعار الجلوكوز، أو منتج من الربط بين الانزيم والأجسام المضادة أو التحقيق.
هنا، نحن تصف طريقة فحص الاستشعار الكهروكيميائية للكشف عن مباشرة وتحديد البكتيريا. في كل حال، فإن تحقيقات الموصوفة هنا [أليغنوكليوتيد الحمض النووي. ويستند هذا الأسلوب على تهجين شطيرة من التقاط وكشف عن تحقيقات مع الهدف الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي). ويرتكز هذا التحقيق القبض على السطح الاستشعار، في حين يرتبط كشف التحقيق إلى Horseradish البيروكسيديز (HRP). عندما يتم إضافة الركيزة مثل 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB) إلى القطب مع التقاط المستهدفة كاشف المجمعات بد أن سطحه، يتأكسد الركيزة التي كتبها HRP وتخفيضها من قبل القطب العمل. هذه النتائج دورة الأكسدة والاختزال في رحلات مكوكية من الإلكترونات من قبل الركيزة من القطب إلى HRP، وتنتج تدفق التيار في القطب.
Introduction
باستخدام الريباسي كما الجزيء المستهدف للكشف عن البكتيريا وتحديد لديها عدد من المزايا. وفرة من الريباسي في الخلايا البكتيرية ينص على حد حساسية منخفضة تصل إلى 250 بكتيريا في المليلتر من دون الحاجة إلى الهدف التضخيم 1. الريباسي البكتيرية يحتوي على تسلسل أنواع محددة الفريدة التي هي في متناول التهجين مع تحقيقات الحمض النووي. وبناء على ذلك، مجموعة من أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية يمكن استخدامها لتحديد البكتيريا غير معروف، حيث يتم functionalized كل أجهزة الاستشعار مع لجنة التحقيق القبض على أنواع محددة مختلفة. وينبغي أن تدرج أجهزة استشعار مراقبة إيجابية للوصول إلى هدف قليل النوكليوتيد الاصطناعية ان "الجسور" التقاط وكشف عن تحقيقات لإنشاء إشارة المعايرة الداخلية.
أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية لديها مجموعة واسعة من التطبيقات البحوث الأساسية ومتعدية. على سبيل المثال، ومقايسة الموصوفة هنا قد استخدمت لقياس بدقة تأثير E. مرحلة النمو القولونية على RRNA والأرقام نسخة ما قبل الريباسي، الذي هو من مصلحة كبيرة للباحثين المهتمين في علم وظائف الأعضاء 2 البكتيرية. يتم تحديد حساسية الفحص الاستشعار الكهروكيميائية بواسطة إشارة إلى نسبة الضوضاء. تم استكشاف مجموعة متنوعة من تضخيم الإشارات وطرق الحد من الضوضاء. نجد أن تحسين كيمياء سطح جهاز الاستشعار هو المفتاح لخفض ملزم غير محدد من كشف التحقيق و / أو إنزيم HRP. على وجه الخصوص، وقد وجد أحادي الطبقة مختلطة من alkanedithiols وmercaptohexanol للحد من الخلفية التي تغطي سطح القطب أكثر تماما مع الحفاظ على سهولة الوصول للمسبار لالتقاط الهدف التهجين 3. هذه العلاجات الكيمياء السطحية لها أهمية خاصة لفحوصات تشمل عينات بيولوجية معقدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
فحص جهاز استشعار الكهروكيميائية صفها هنا يمكن الكشف السريع عن الأهداف الحمض النووي. حساسية وخصوصية تعتمد في جزء منها على الطاقة الحرة من التهجين الهدف مسبار، والتي تعتمد بدورها على طول والمحتوى GC من التقاط وكشف تحقيقات. نحن عادة بتنفيذ الخطوات التهجين عند درجة حرار?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل جائزة الاتفاق التعاوني AI075565 (لداه) من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والتي يندي وصندوق روبي كين للتميز في أبحاث المسالك البولية للأطفال. BMC هو جوديث وروبرت ونستون في كرسي المسالك البولية للأطفال.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. |
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
