גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים
Summary
אנו מתארים שיטת assay חיישן אלקטרוכימי לגילוי חיידקים מהיר והזדהות. Assay כרוך מערך חיישנים פונקציונליות עם בדיקות ללכוד oligonucleotide DNA ל( rRNA) רצפי מינים ספציפיים ריבוזומלי RNA. הכלאה כריך של rRNA היעד עם הבדיקה ללכוד ובדיקת גלאי דנ"א oligonucleotide peroxidase צמודת חזרת מייצרת נוכחית amperometric למדידה.
Abstract
חיישנים אלקטרוכימיים נמצאים בשימוש נרחב למדידה מהירה ומדויקת של רמת סוכר בדם, ויכולים להיות מותאם לזיהוי של מגוון רחב של analytes. חיישנים אלקטרוכימיים לפעול על ידי transducing אירוע הוקרה ביולוגי לאות חשמלי שימושי. התמרה אות מתרחשת על ידי צימוד הפעילות של אנזים חיזור לאלקטרודה amperometric. הספציפיות חיישן היא גם מאפיין מהותי של האנזים, גלוקוז אוקסידאז במקרה של חיישן גלוקוז, או תוצר של קשר בין האנזים ונוגדן או הבדיקה.
כאן, אנו מתארים שיטת assay חיישן אלקטרוכימי כדי לזהות באופן ישיר ולזהות חיידקים. בכל מקרה, הבדיקות שתוארו כאן הן oligonucleotides DNA. שיטה זו מבוססת על הכלאה כריך של בדיקות ללכוד וגלאי עם היעד RNA ריבוזומלי (rRNA). הבדיקה ללכוד מעוגנת למשטח החיישן, ואילו הבדיקה הגלאי קשורה לשעותperoxidase orseradish (HRP). כאשר מצע כגון 3,3 ", 5,5"-tetramethylbenzidine (TMB) הוא הוסיף לאלקטרודה עם מתחמים ללכוד יעד גלאים מאוגדים פני השטח שלו, המצע הוא חמצון על ידי HRP ומופחת על ידי אלקטרודה לעבוד. תוצאות מחזור חיזור זה בדילוגים של אלקטרונים על ידי המצע מהאלקטרודה לHRP, ייצור זרימת זרם באלקטרודה.
Introduction
שימוש rRNA כמולקולת מטרה לאיתור וזיהוי חיידקים יש מספר היתרונות. השפע של rRNA בתאי חיידקים מספק לגבול רגישות נמוך כמו 250 חיידקים למ"ל, ללא צורך בהגברת 1 היעד. rRNA חיידקים מכיל רצפי מינים ספציפיים ייחודיים כי הם נגישים להכלאה עם בדיקות ה-DNA. כתוצאה מכך, מערך של חיישני אלקטרו יכול לשמש כדי לזהות חיידקים לא ידועים, שבו כל חיישן פונקציונלי עם בדיקה ללכוד מינים ספציפיים שונה. חיישני בקרה חיוביים צריכים להיכלל ליעד oligonucleotide סינטטי ש" גשרים "ללכוד ובדיקות גלאים ליצור אות כיול פנימית.
יש חיישנים אלקטרוכימיים מגוון רחב של יישומי מחקר בסיסיים ותרגומים. לדוגמה, assay מתואר כאן נעשה שימוש כדי למדוד את ההשפעה של א 'דווקא שלב צמיחת חיידק בRRNלהעתיק מספרים מראש rRNA ו, שהוא עניין רב לחוקרים המעוניינים בחיידקי פיזיולוגיה 2. הרגישות של assay חיישן אלקטרוכימי נקבעת על ידי יחס האות לרעש. מגוון רחב של שיטות והגברת אות להפחתת רעש נחקר. אנו מוצאים כי שיפור הכימיה של פני השטח החיישן הוא מפתח לצמצום כריכה ספציפי של בדיקה ו / או אנזים HRP גלאי. בפרט, monolayer מעורבת של alkanedithiols וmercaptohexanol כבר מצא להפחית את הרקע על ידי כיסוי פני האלקטרודה יותר לחלוטין תוך שמירה על הנגישות של הבדיקה ללכוד להכלאת היעד 3. טיפולי כימיה של פני שטח אלה חשובים במיוחד עבור מבחני הכוללים דגימות ביולוגיות מורכבות.
Protocol
Representative Results
Discussion
Assay חיישן אלקטרוכימי המתואר כאן מאפשר זיהוי מהיר של מטרות חומצות גרעין. רגישות וסגוליות תלויים בחלקו על האנרגיה החופשית של הכלאה יעד חללית, אשר בתורו תלוי באורך ותוכן GC של הלכידה ובדיקות גלאים. אנחנו בדרך כלל לבצע את פעולות ההכלאה בטמפרטורת הסביבה (~ 20 מעלות צלזיוס) <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על הסכם שיתוף פעולה AI075565 פרס (לDAH) מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות על ידי ועל ידי ונדי וקרן קן רובי למצוינות במחקר אורולוגיה ילדים. BMC היא יהודית ויו"ר רוברט וינסטון באורולוגיה ילדים.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 6-mercapto-1-hexanol (MCH) | Sigma | 451088 | Store at room temperature |
| 1,6-hexanedithiol (HDT) | Sigma | H-12005 | Store at room temperature |
| Thiolated capture probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Fluorescein-modified detector probes | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Bridging Oligonucleotide | Operon | N/A | Store at 100 μM in 0.1x TE at -20 °C |
| Anti-Fluorescein-HRP, Fab fragments | Roche | 11 426 346 910 | Store at 4 °C |
| Helios Chip Reader | GeneFluidics | GFR-2009 | |
| Sensor Chip Mount | GeneFluidics | GFR-003 | |
| Film well sticker | GeneFluidics | Shipped with sensor chips | |
| Bare gold 16-sensor array chips | GeneFluidics | SC1000-16X-B | Store in 100% N2 at room temperature |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| 1M Phosphate Buffer, pH 7.2 | 0.35M NaH2PO4, 0.65M K2HPO4, adjusted to pH 7.2 | ||
| Blocker Casein in PBS | Pierce | 37528 | Dilute with an equal volume of 1M Phosphate Buffer, pH 7.2, store at 4 °C |
| Table 1. Reagents and Equipment. |
References
- Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
- Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, (2012).
- Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
- Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
- Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
- Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
- Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
- Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
- Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
- Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
- Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
- Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).
