Denne videopresentasjonen viser en fremgangsmåte for å høste de to viktigste svært vaskulære strukturer som støtter forhjerne funksjonen. De er cerebral overflate (overfladisk) blodkar sammen med tilhørende hjernehinnene (MAV) og årehinnen plexus som er nødvendige for cerebral blodstrøm og cerebrospinalvæsken (CSF) homeostase.
Denne videoen presentasjonen ble opprettet for å vise en metode for å høste av de to viktigste svært vaskulære strukturer, ikke bosatt i hjernen riktig, som støtter forebrain funksjonen. De er cerebral overflate (overfladisk) blodkar sammen med tilhørende hjernehinnene (MAV) og årehinnen plexus som er nødvendige for cerebral blodstrøm og cerebrospinalvæsken (CSF) homeostase. Vevet høstes er egnet for biokjemiske og fysiologiske analyse, og MAV har vist seg å være følsomme for skade produsert av amfetamin og hypertermi 1,2. I tillegg de store og små cerebrale vasculatures høstet i MAV er av potensielt høye renter når undersøke concussive typer hodeskade. MAV dissekert i denne presentasjonen består av pial og noen av araknoide membranen (mindre dura) i hjernehinnene og dur og moll cerebral overflate blodkar. Årehinnen plexus dissekert er strukturen som ligger i lateral ventriklene som beskrevet av Oldfield og McKinley 3,4,5,6. Metodene som benyttes for høsting disse to vev også lette høsting av regionale kortikale vev blottet for hjernehinnene og større cerebral overflate vaskulaturen, og er kompatibel med høsting andre hjernen vev som striatum, hypothalamus, hippocampus, etc. disseksjon av de to vev tar 5-10 min totalt. Genuttrykket nivåer for dissekert MAV og årehinnen plexus, som vist og beskrevet i denne presentasjonen finner du på GSE23093 (MAV) og GSE29733 (årehinnen plexus) på NCBI GEO depotet. Denne informasjonen har vært, og blir, brukes til å hjelpe videre forstå funksjonen av MAV og årehinnen plexus og hvordan nevrotoksisk hendelser som alvorlig hypertermi og Amph påvirke deres funksjon.
Tekniske aspekter ved MAV og årehinnen plexus disseksjon
Det er kritisk under disseksjon av MAV å ha hjernen "nedsenket" mesteparten av tiden i den vanlig saltoppløsning eller natriumfosfat-bufret saltvann. Slik at MAV og cortex å dehydrere under disseksjon vil resultere i MAV følger tett til kortikale lag I. Dette vil øke mengden av kortikale vev høstet med MAV og / eller resultat i manglende evne til å fjerne disse fulgte MAV seksjoner fra hjernebarken. Dessuten er tålmodighet nødvendig under disseksjon. Igjen, hvis man møter noe motstand i å fjerne MAV fra cortex i en halvkule under disseksjon, bytt til den andre halvkule og gå tilbake senere til side hvor motstanden ble påtruffet. Denne metoden tar litt praksis for å perfeksjonere og krever ca 5 til 15 "praksis" disseksjoner før en konsekvent enhetlig høsting av MAV vev er oppnådd. Metoden for å starte disseksjon og removal av MAV ved arteriell sirkelen ved foten av hjernen forenkler fjerning av hjernehinnene ved hjelp større vaskulaturen som støtte "stillas".
Mye av blodet opprinnelig MAV vaskulaturen etter avliving bør bli slynget under disseksjon, og mindre enn 5% av RNA høstet fra MAV bør være av blod opprinnelse. Det er mulig å fjerne nesten alle blodet ved perfusing dyret med 50 til 70 ml saltoppløsning, ved hjelp histologiske teknikker, før halshogging og hjernen fjernes. Imidlertid er det da mye mer vanskelig å visualisere MAV vev under disseksjonen. De tre mest sannsynlige kilder "forurensning" av de MAV vev er pinealkjertelen, kortikale lag jeg vev og gjenværende luktelappen vev, men det er også mulig å få hypofysen vev i preparatet. Pineal forurensning i MAV oppdages av MAV inneholder en runde 1 til 2 mm diameter sfære som er farget mørk rød. Den primære funksjonenav pinealkjertelen normalt antas å være helt forskjellig fra MAV. Hovedfunksjonen er å produsere melatonin, som regulerer aspekter av døgnrytmen 9, og i 10 av lipoxygenation lipid forløpere. Selv om genet Lox, som regulerer lipoksygenase aktivitet ble antatt å være tilstede i voksne primært i pinealkjertelen 10, våre resultater tyder på at det også er til stede på konsekvent signifikante nivåer i MAV. Residual kortikale eller luktelappen kontaminering resultater i rosa web-lignende MAV vev ha noen 1-2 mm denser vev som er mye blekere i fargen omsluttet i den. Dette kan bli oppdaget av "flytende" MAV på overflaten av bufferen, og deretter fjerne de tyngre kortikale eller pære vev med de to dissecting pinsett.
Hvis forurensning av MAV fra kortikale lag jeg vev, hypothalamus vev eller pinealkjertelen er til stede, deretter flere gener vil ha en vesentligdelig større uttrykk enn det som er normalt finnes i en "ren" disseksjon. Forurensning av MAV med pinealkjertelen vil resultere i høyere ekspresjon av arylalkylamine N-acetyltransferase (Aanat) som er nødvendig for melatonin syntese. Dessverre, hvis pineal kontaminering oppstår under MAV disseksjon, vil nivåene av Lox i MAV ikke kunne bestemmes nøyaktig. Forurensning av MAV med kortikale vev vil resultere i høyere uttrykk av neuron-spesifikke gener som hippocalcin (Hpca), parvalbumin (Pvalb) og / eller neuronal pentraxin reseptor (Nptxr). Forurensning av MAV med hypothalamus vev vil resultere i høyere uttrykk av veksthormon 1 (GH1), proopiomelanocortin (POMC). I tilfelle at noen forurensning eksisterer i de høstede vev, kan de fleste av disse gener bli identifisert og ikke brukt i genekspresjonsanalyse. Dette er spesielt viktig for gener som er tilstede i den sirkulerende blood som fremdeles kan være til stede i MAV eller årehinnen plexus.
Interpretting genekspresjonsdata fra slaktet MAV og årehinnen plexus
Cerebral overflate (overflatisk) vaskulatur sammen med tilhørende meninges (MAV) og choroid plexus er nødvendig for cerebral blodstrøm og cerebrospinal væske (CSF) homeostase 4,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Vevet innhøstingen er egnet for biokjemiske og fysiologiske analyse, og MAV har vist seg å være følsomme for skade produsert av amfetamin og hypertermi 1,2 gjennom genekspresjonsanalyse. Disse resultatene er i samsvar med det som er også kjent om alvorlig hypertermi og eksponering for amfetamin til hjernen vaskulaturen generelt 18,19,20. Kliniske data støtter troen på at subdural blodkar er følsom for skade ved amfetamin og metamfetamin 21,22. I tillegg inklu de store og små cerebrale vasculaturesing de i pial lag av hjernehinnene som høstes i MAV er av potensielt høye renter når undersøke concussive typer hodeskader 23,24 25. Den nåværende genuttrykk profil ga fra MAV indikerer at pial og muligens de araknoide meningeal membraner kan spille en større rolle enn forventet i å regulere CSF sammensetning. I fremtiden, gjennom bruk av disseksjonsmikroskop teknikker, kan det være mulig å ytterligere separere vev omfattende MAV slik at pial og araknoide membraner kan separeres fra større arterielle blodkar stede og eventuelt fra hverandre. Dette vil muliggjøre en bedre forståelse av funksjonen av hver av disse tre komponentene av høstet MAV.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av NCTR / FDA.
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Normal Saline (9 grams saline/ 1 Liter H2O) | In-house | Dissection buffer | |
0.1 M Sodium Phosphate pH 7.4 | In-house | Dissection buffer | |
Bone Rongeurs | Roboz | RS-8300 | Skull bone removal |
Forceps-bent tip (4″ long & 0.8 mm wide tip) | Roboz | RS-5135 or RS-5137 | Dissecting forceps |
Forceps-straight tip (5.5″ long ) | Roboz | RS-8124 or RS-8104 | Thumb Dressing forceps |