Den här artikeln innehåller ett protokoll för odling av Arabidopsis plantor i RootChip, en mikroflödessystem imaging plattform som kombinerar automatiserad styrning av odlingsbetingelser med mikroskopisk roten övervakning och FRET-baserad mätning av intracellulära metaboliten nivåer.
De root fungerar som den fysiska ankare av anläggningen och är det organ som ansvarar för upptag av vatten och mineraler näringsämnen som kväve, fosfor, sulfat och spårämnen som växterna förvärvar från marken. Om vi vill utveckla hållbara metoder för att producera hög avkastning, måste vi bättre förstå hur roten utvecklas, tar upp ett brett spektrum av näringsämnen och interagerar med symbiotiska och patogena organismer. För att uppnå dessa mål, måste vi kunna utforska rötterna i mikroskopisk detalj under tidsperioder som sträcker sig från minuter till dagar.
Vi utvecklade RootChip, en polydimetylsiloxan (PDMS) – baserad mikroflödessystem enhet, vilket ger oss möjlighet att växa och rötterna bild från Arabidopsis plantor och samtidigt undvika fysisk stress rötterna under beredning för avbildning 1 (figur 1). Enheten innehåller en tvådelad kanalstruktur med mikromekaniska ventiler för att styra vätskeflödetfrån lösning inlopp till var och en av de åtta observationskammare 2. Detta perfusion system tillåter roten mikromiljön ska styras och ändras med precision och snabbhet. Volymen av kamrarna är ungefär 400 nl, vilket således kräver endast minimala mängder av testlösningen.
Här erbjuder vi ett detaljerat protokoll för att studera root biologi på RootChip med imaging-baserade metoder i realtid upplösning. Rötter kan analyseras under flera dagar med mikroskopi tid förflutit. Rötter kan perfuseras med näringslösningar eller inhibitorer, och upp till åtta plantor kan analyseras parallellt. Detta system har potential för ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive analys av rottillväxten i närvaro eller frånvaro av kemikalier, fluorescens-baserad analys av genuttryck och analys av biosensorer, t.ex. FRET nanosensorer 3.
De huvudsakliga fördelarna med RootChip jämfört med konventionella odlingsmetoder är den minimalt invasiva förberedelse för mikroskopi, förmågan att reversibelt och upprepade gånger ändrar roten miljö, och kapaciteten för kontinuerlig observation av utvecklingsmässigt kompetenta och fysiologiskt frisk vävnad under en period av flera dagar. Tidigare var plantorna växa vertikalt på gelade media och överförs till en perfusionssystem omedelbart före försöket, som endast tillät att mäta enstaka rötter i taget 8. Mikroflödessystem verktyg har använts för Arabidopsis, men på en låg integration nivå 9 eller utan perfusion kontroll 10. Den RootChip kombinerar en hög grad av integration med förmågan att automatisera experiment genom noggrann flödet vägledning. En annan fördel med denna plattform, karakteristisk för alla mikroflödessystem enheter 11, är att endast minimala mängder vätska skyldiga att lämna roten med nödvändig mutternrients, även för experiment som spänner över flera dagar. Den RootChip närvarande utformad som en engångsbruk enhet, men eftersom produktionskostnaderna för chips är låga, gör små mängder som konsumeras reagenser chipet fortfarande mycket kostnadseffektivt.
Det finns några viktiga steg som måste vidtas för att garantera hälsa plantor:
Volymen i plastkoner är endast 3-4 | il, vilket kommer att börja torka vid exponering för luft. Följaktligen är det kritiskt att konerna överförs på chipset snabbt och fuktighet hålls hög tills rötterna har nått observationskammare och som kommer att leverera dem med tillräcklig mängd vatten. Steg 4.2 till 4,5 bör utföras snabbt och utan avbrott för att förhindra uttorkning av plantorna.
Steg 3,5 – 3,8 beskriva inkubering av chip på flytande medier under vilken rötterna växer in i observation kamrarna. Detta steg kan hoppas över genom att montera chip i Carrier omedelbart och börjar ständigt perfusion med tillväxt medium. Vi rekommenderar dock blötläggning i odlingsmedium över natten, eftersom det har vissa fördelar: 1) det skapar en fuktig miljö så plantorna är mindre risk att bli uttorkad när de växer in observationen kammaren, 2) chip är indränkt i flytande så avgasning (steg 6,4) kommer att bli snabbare.
Det är viktigt att använda medier med låga koncentrationer av lösta ämnen. Mer koncentrerade lösningar kan fälla ut och sätta igen kanalerna, i synnerhet om chip används under flera dagar.
När enheten är ansluten till tryckluftledningen, är flödet av mediet regleras genom att ändra hydraultryck i ventilerna. Att säkerställa en korrekt stängning av mikromekaniska ventiler, är det viktigt att välja en kontroll tryck som är cirka tre gånger högre än flödet trycket. Flödet tryck bör inte överstiga 15 psi då fluiden kommer att tryckas ut från rot inloppen. Högre tryck may orsakar också delaminering av chipet, vilket gör chipet oanvändbar.
En begränsning av RootChip är att PDMS är porös och hydrofob. Medan materialet är praktiskt taget inert mot vattenlösningar, kan det absorbera organiska föreningar 12. Detta kan störa ett snabbt utbyte av lösningar som organiska föreningar kan läcka från materialet, även när tillförseln av denna förening har stoppats vid inloppet. På grund av den porositet, kan användning av organiska lösningsmedel orsakar svallning av PDMS 12.
Vi fortsätter att optimera RootChip och utöka dess användbarhet, till exempel med rötter grödor. Vi tror att genom att förbättra tillgången till roten för behandling och observation kommer mikroflödessystem verktyg som RootChip öppnar nya dimensioner rot forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Philipp Denninger för att få hjälp med video förberedelser och Bhavna Chaudhuri för att ge växter som uttrycker FRET sensorer. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Science Foundation (MCB 1.021.677), Department of Energy (DE-FG02-04ER15542) för att WBF, National Institutes of Health, och Howard Hughes Medical Institute i SRQGG stöddes av en EMBO långt sikt gemenskap. MM fick stöd av Alexander von Humboldt-stiftelsen.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |