Достижения в области масс-спектрометрии позволило высокой пропускной анализ экспрессии белка и изменения в целый ряд тканей. В сочетании с субклеточных фракционирования и болезни модели, количественные масс-спектрометрии и биоинформатика может выявить новые свойства в биологических системах. Метод, описанный здесь анализ хроматин-ассоциированных белков в условиях болезни сердца и легко применим и к другим<em> В естественных условиях</em> Моделей человеческих заболеваний.
В ядре находятся протеомов, функции которых наиболее тесно связана с генной регуляции. Взрослых млекопитающих ядер кардиомиоцитов являются уникальными в связи с высоким процентом двуядерных клеток, 1 преимущественно гетерохроматиновых состояния ДНК, и без деления характера кардиомиоцитов взрослого, который оказывает ядер в постоянном состоянии интерфазы 2. Регуляция транскрипции в процессе разработки и Болезнь была хорошо изучена в этом органе, 3-5, а то, что остается относительно неисследованной является роль, которую играют ядерные белки, отвечающие за упаковку ДНК и экспрессии, и как эти белки контролировать изменения в транскрипционной программы, которые происходят во время болезни. 6 В развитых мира, болезнь сердца является причиной номер один смертности для мужчин, так и женщин. 7 Insight о том, как ядерные белки сотрудничать регулировать прогрессирование этого заболевания имеет решающее значение для продвижения современного лечения Options.
Масс-спектрометрия является идеальным инструментом для решения этих вопросов, поскольку оно позволяет объективно аннотации ядерного протеома и относительное количественное о том, как обилие этих белков изменяется с болезнью. Хотя было несколько протеомных исследований для млекопитающих ядерные белковые комплексы, 8-13 до недавнего времени 14 было только одно исследование изучения сердечных ядерной протеома, и это считается всего ядра, а не изучения протеома на уровне отсеков АПЛ 15. В значительной степени этот недостаток работы связано с трудностью выделения сердечной ядер. Сердечная ядер происходит в жесткой и плотной актин-миозин аппарат, к которому они подключены через несколько расширений эндоплазматической сети, в той степени, миоцитов изменяет сокращение их общей форме 16. Кроме того, кардиомиоцитов на 40% митохондрий по объему 17, который necessitaTES обогащения ядро отдельно от других органелл. Здесь мы опишем протокол для сердечной обогащению урана и дальнейшего фракционирования в биологически соответствующие отсеки. Кроме того, мы подробно методы этикетки без количественного масс-спектрометрического рассечение этих фракций, методы поддаются в естественных условиях эксперименты в различных животных моделях и систем органов, где метаболические маркировке не представляется возможным.
Два основных методов ядерной изоляции были рассмотрены ранее: 27 одно Беренс техники гомогенизации лиофилизированных тканей в неводных растворителей и второй, модификация, которую мы используем здесь, гомогенизации ткани в водный сахароза / солевой раствор следует дифференциал?…
The authors have nothing to disclose.
Vondriska лаборатории при поддержке грантов от Национального института сердца, легких и крови NIH и Laubisch фонда в Лос-Анджелесе. EM является получателем Дженнифер С. Бухвальд стипендий в области физиологии в Лос-Анджелесе; HC является лауреатом Американской Ассоциации Сердца предварительного докторских стипендий; MP является получателем NIH Рут Kirschstein пост-докторские стипендии и SF является получателем NIH K99 Award.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 |
Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 |
100 μm strainer | BD Falcon | 352360 |
Ultracut ultramicrotome | Reichert | |
100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | |
Oriole | BioRad | 161-0496 |
Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 |
Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 |
Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 |
BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 |
Tubulin antibody | Sigma | T1568 |
Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 |
Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 |
SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 |
E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 |
Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 |
Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 |
BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 |
Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 |
BioWorks Browser | Thermo Scientific |