وقد سمح التقدم في مطياف الكتلة لتحليل إنتاجية عالية البروتين التعبير والتعديل على مجموعة من الأنسجة. جنبا إلى جنب مع تجزئة التحت خلوية ونماذج المرض والكتلة الطيفي الكمي والمعلوماتية الحيوية يمكن أن تكشف عن خصائص جديدة في النظم البيولوجية. الطريقة الموضحة هنا يحلل لونين البروتينات المرتبطة في تحديد أمراض القلب وينطبق بسهولة إلى أخرى<em> في الجسم الحي</em> نماذج من الأمراض التي تصيب البشر.
في النواة الموجودة في proteomes التي هي الأكثر ارتباطا وثيقا وظائف مرتبطة مع تنظيم الجينات. الكبار نوى cardiomyocyte الثدييات هي فريدة من نوعها نظرا لنسبة عالية من الخلايا binucleated، 1 heterochromatic الدولة في الغالب من الحمض النووي، وطبيعة تقسيم غير من cardiomyocyte مما يجعل نوى الكبار في حالة دائمة من الطور البيني .. 2 تنظيم الترانسكربتي خلال تطوير و وقد المرض مدروسة في هذا الجهاز، 3-5 ولكن ما زال غير مستكشفة نسبيا هو الدور الذي تقوم به البروتينات النووية المسؤولة عن التعبئة والتغليف DNA والتعبير، وكيف يمكن لهذه البروتينات السيطرة تغييرات في برامج النسخ التي تحدث أثناء المرض. 6 في تطوير العالم، وأمراض القلب هي السبب الأول للوفيات لكل من الرجال والنساء .. 7 انسايت حول كيفية البروتينات النووية لتنظيم التعاون تطور هذا المرض أمر بالغ الأهمية للنهوض الحالية س العلاجيارات.
قياس الطيف الكتلي هو الأداة المثالية لمعالجة هذه الأسئلة لأنها تسمح للتعليق توضيحي متحيز للبروتيوم الكمي النووية والنسبية لكيفية وفرة من هذه البروتينات مع التغيرات المرض. في حين كانت هناك دراسات عدة عن البروتين البروتين الثدييات المجمعات النووية، 8-13 وحتى وقت قريب كان هناك 14 دراسة واحدة فقط فحص القلب النووي بروتيوم، وأنها تعتبر نواة بأكملها، بدلا من استكشاف بروتيوم على مستوى حجرات فرعية النووية 15 في جزء كبير منه، هذا النقص في العمل ويرجع ذلك إلى صعوبة عزل نواة القلب. نوى القلب تحدث داخل جهاز أكتين الميوسين-جامدة وكثيفة لأنها التي ترتبط عبر ملحقات متعددة من الشبكة الإندوبلازمية، إلى الحد الذي يغير شكل خلية عضلية تقلص بشكل عام 16 بالإضافة إلى ذلك، cardiomyocytes هي 40٪ من حيث الحجم الميتوكوندريا 17 الذي necessitaقسم التدريب والامتحانات إثراء النواة وبصرف النظر عن العضيات الأخرى. نحن هنا وصف بروتوكول للتخصيب النووي وتجزئة القلب الى مزيد من حجرات بيولوجيا ذات الصلة. وعلاوة على ذلك، فإننا طرق بالتفصيل لتسمية خالية تشريح الشامل الكمي الطيفي لهذه الكسور تقنيات قابلة للتجريب في الجسم الحي في النماذج الحيوانية المختلفة وأجهزة الجسم حيث وضع العلامات الأيضية ليست مجدية.
وقد استعرضت طريقتين رئيسيتين لعزل النووية سابقا: 27 واحد هو أسلوب بيرنس من المجانسة الأنسجة مجفف بالتجميد في المذيبات غير المائية، والثاني، وهو التعديل الذي نستخدمه هنا، من التجانس في الأنسجة السكروز المائي / محلول الملح يتبع بواسطة الطرد المركزي أو الفرق الكث…
The authors have nothing to disclose.
يتم اعتماد مختبر Vondriska من المنح المقدمة من معهد القلب والرئة والدم الوطني من المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة Laubisch في جامعة كاليفورنيا. EM هو المستفيد من جنيفر S. زمالة دراسات عليا في الفسيولوجيا بوخفالد في جامعة كاليفورنيا؛ HC وهو حاصل على زمالة القلب الأمريكية ما قبل الدكتوراه جمعية؛ MP وهو حاصل على زمالة روث NIH ما بعد الدكتوراه كيرشتاين، وSF وهو حاصل على وK99 NIH جائزة.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 |
Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 |
100 μm strainer | BD Falcon | 352360 |
Ultracut ultramicrotome | Reichert | |
100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | |
Oriole | BioRad | 161-0496 |
Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 |
Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 |
Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 |
BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 |
Tubulin antibody | Sigma | T1568 |
Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 |
Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 |
SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 |
E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 |
Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 |
Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 |
BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 |
Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 |
BioWorks Browser | Thermo Scientific |