질량 분광법의 발전은 조직의 호스트에 단백질 표현 및 수정의 높은 처리량 분석을 허용하고 있습니다. subcellular 분류 및 질병 모델, 분광 및 생물 정보학은 생물 시스템에 새로운 속성을 표시 할 수 있습니다 양적 질량과 결합. 여기에 설명 된 방법은 심장 질환의 설정에 염색질 - 관련 단백질을 분석하고 다른 사람에게 쉽게 적용 할 수 있습니다 생체 내 인간의 질병의 모델.
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이 논문에서
요약
초록
핵에서 누구 기능을 가장 밀접한 유전자 조절과 연결되어 proteomes을 거주. 성인 포유류의 cardiomyocyte의 핵은 binucleated 세포의 높은 비율 1 DNA의 주로 heterochromatic 상태에 따라 고유하며, 개발 중에 계면의 영구적 인 상태에 성인 핵을 렌더링 cardiomyocyte의 비 분리 자연 2. 전사 규제와 병은 잘이 단백질이 질병 중에 발생하는 전사 프로그램에 변경 사항을 관리하는 방법이 오르간, 3-5에서 공부하지만 상대적으로 미개척 남아는 DNA 포장과 표현에 대한 책임 핵 단백질에 의해 연주 역할이며,되었습니다. 6 개발에 세계 심장 질환은 남성과 여성 모두에 대한 사망률의 최고의 원인입니다. 핵 단백질이 질병의 진행을 조절하는 협력 방법에 대한 일곱 통계는 현재 치료 O를 발전을위한 중요합니다습니.
질량 분석법은 병 어떻게 이러한 단백질의 풍부한 변경을위한 핵 프로테옴와 상대 정량화의 편견 주석을 허용 이러한 문제에 대응을위한 이상적인 도구입니다. 최근까지 포유류의 핵 단백질 단지, 8-13 여러 proteomic 연구가되어있는 동안 14 심장 핵 프로테옴을 검토 한 연구가있다, 그것은 오히려 핵 하위 구획의 수준에서 프로테옴을 둘러보다, 전체 핵을 고려 . 많은 부분에서 15 일이 부족 심장 핵을 분리의 어려움 때문입니다. 심장 핵은 myocyte 수축 변하는 자신의 전반적인 모양. 16 또한, cardiomyocytes 볼륨 17으로 40% 미토콘드리아이라는 범위, 그들이 endoplasmic 소포체에서 여러 확장을 통해 연결되어 할 수있는 강성과 고밀도 고를 - 마이 오신 장치에서 발생하는 necessita다른 세포 소기관에서 떨어져 핵의 농축 tes. 여기 생물학적 관련성이 높은 구획에 심장 핵 농축 및 추가 분류를위한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 신진 대사 라벨이 적합하지 않을 다양한 동물 모델 및 장기 시스템의 생체 실험의 의무 분수는 - 기술의 라벨이없는 정량 대량 spectrometric 해부에 대한 세부 방법.
프로토콜
실험 워크 플로우 일곱 주요 단계 (그림 1)가 포함되어 있습니다. 질량 분석계에서 실행됩니다 샘플을 포함한 모든 작업은 실험은 실험실 코트, 장갑, 헤어 넷을 착용, 먼지, 각질의 개인 흘림의 오염을 방지하기 위해주의를 기울여야한다.
1. 심장 균질화 및 핵 절연
마우스 마음이 균질하고 그대로 핵 펠릿은 (그림 2) 절연되어 있습니다.
- 성인 마우스를 희생 소비세 심장, 얼음처럼 차가운 PBS로 씻어, 2 ML을 포함하는 (우리가 피셔의 휘튼의 조직 그라인더, # 08-414 - 13A을 선호하지만, 다른 방법 동등하게 잘 작동 할 수 있습니다) 유리 다운스 호 모지 얼음 속에서 균질화 용해 버퍼 (10 MM 트리스 산도 7.5, 15 MM NaCl, 그리고 0.15 % V / V Nonidet P-40 [NP-40] 탈 이온수의 플러스 (differentially 핵을 포함한 세포 소기관으로 세포 멤브레인을 lyses hypotonic 솔루션)의 단백 분해 효소와 인산 가수 분해 효소 전nhibitor 혼합 : 10 MM 나트륨 부티르산, 0.1 밀리미터 phenylmethylsulfonyl 플루오르 화 [....
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결과
그림 4는 상대적으로 정량화이 양식의 유틸리티를 강조 표시합니다. 왼쪽 패널에 표시되는 단백질 HMGB1 (데이터베이스 검색을 통해 확인)에 속하는 것으로 지정되어 개별 monoisotopic 펩타이드 피크는 (다른 마우스에서 중첩)입니다. 각 피크는 기본적으로 주어진 펩타이드에 대한 추출 이온 크로마토 그래프는 다른 마우스에서 제공합니다. 세 생물 각 그룹에 대한 복제와 함께 기초, 심장 비대 및 심장 마비 :이 그룹은 세 가지 생리 상태를 나타냅니다. 곡선 아래 영역을 통합함으로써, 상대적으로 풍부한가 계산 될 수있다. 중앙 패널에서 이러한 abundances의 평균이 표시됩니다. 이 HMGB1 단백질의 풍부한이 질병의 과정 중에 변경되는 분석이 유형에서 분명하다. 대조적으로, 하단 패널은 질병으로 변경되지 않습니다 히스톤 H4의 예를 보여줍니다. 두 경우 모두, 펩티드 같은 phenot의 동물에서 오는ypic 상태의 샘플 준비 및 LC / MS / MS의 재현성을 보여 유사한 용출 프로파일과.......
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토론
핵 절연을위한 두 가지 방법은 이미 검토 한 : 27 하나는 수성 자당 / 소금 용액에 조직을 homogenizing의 비 수성 용매에 동결 건조 된 조직을 homogenizing의 Behrens 기술과 두 번째, 우리가 사용하는의 수정입니다 다음 차동 또는 밀도 기울기 원심 분리에 의해.
조직 샘플에서 산 추출하여 핵의 Subfractionation은 histones을 분석되는 원본을 목표로 1960, 28 년부터 사용 된 염색질을 공부하기위한 중요한 도구입니다. 산 추출 프로토콜은 핵심 nucleosomal histones 구성 요소를 정화의 목표를 위해 개발 된 29이 이전 연구의 한계는 비 히스톤 단백질 구성, 그리고 염색질 수정에 대한 정보의 부재이다;. 우리는 현재의 프로토콜로이 문제를 해결했습니다 핵 및 염색질의 독특한 생물학적 subfractions을 특성화하십시오.병렬로 세제 추출 또는 염색질의 산.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
Vondriska 연구소는 NIH와 UCLA에서 Laubisch 기금의 국립 심장 폐 혈액 연구소에서 보조금에 의해 지원됩니다. EM은 UCLA의 생리학에서 제니퍼 S. Buchwald 대학원 동지의 수상자이다, HC는 미국 심장 협회 사전 박사의 원정이 수상자이다, MP는 NIH 루스 Kirschstein 포스트 박사의 원정이받는 것입니다, 그리고 SF가의 수신자입니다 NIH K99 수상.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| Dulbeco 수정일 독수리 중 | Invitrogen | 11,965 | |
| 단백 분해 효소 펠릿 | 로슈 | 04 693 159 001 | |
| 100 μm의 스트레이너 | BD 팔콘 | 352360 | |
| Ultracut ultramicrotome | 라이 | ||
| 100CX 전송 전자 현미경 | JEOL USA 주식회사 | ||
| 꾀꼬리 | BioRad | 161-0496 | |
| 히스톤 H2A 항체 | 산타 크루즈 (Santa Cruz) | SC-8648 | |
| Nucleoporin p62 항체 | BD Biosciences | 610498 | |
| 아데닌 nucleo조수 전송 항체 | 산타 크루즈 (Santa Cruz) | SC-9299 | |
| bip (빨리) 항체 | 산타 크루즈 (Santa Cruz) | SC-1050 | |
| Tubulin 항체 | 시그마 | T1568 | |
| 히스톤 H3 항체 | Abcam | ab1791 | |
| Fibrillarin 항체 | 셀 시그널링 | C12C3 | |
| SNRP70 항체 | Abcam | ab51266 | |
| E2F-1 항체 | 온도 피셔 | MS-879 | |
| Retinoblastoma 항체 | BD Biosciences | 554136 | |
| Hypoxia inducible 인자-1 항체 | Novus 체액 | NB100-469 | |
| BCA 단백질 분석 | 열 과학 | 23,227 | |
| 위상 열을 역방향 | 새로운 OBJective | PFC7515-B14-10 | |
| BioWorks 브라우저 | 열 과학 |
참고문헌
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P.
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