Analyse quantitative des Protéomes chromatine dans la maladie
Summary
Les progrès de la spectrométrie de masse ont permis l'analyse à haut débit de l'expression protéique et la modification dans une multitude de tissus. Combiné avec fractionnement subcellulaire et modèles de maladies, spectrométrie de masse quantitative et de la bioinformatique peut révéler de nouvelles propriétés dans les systèmes biologiques. Le procédé décrit ici analyse des protéines associées à la chromatine dans le cadre d'une maladie cardiaque et est facilement applicable à d'autres<em> In vivo</em> Modèles de maladies humaines.
Abstract
Dans le noyau résident les protéomes dont les fonctions sont le plus intimement lié à la régulation des gènes. Adulte noyaux des cardiomyocytes de mammifères sont uniques en raison du pourcentage élevé de cellules binucléées, 1 l'état hétérochromatique principalement de l'ADN, et la nature non-division du cardiomyocyte qui rend noyaux adulte dans un état permanent d'interphase. 2 Régulation transcriptionnelle au cours du développement et maladie ont été bien étudiés dans cet organe, 3-5, mais ce qui reste relativement inexploré est le rôle joué par les protéines nucléaires responsables de l'empaquetage de l'ADN et de l'expression, et comment ces protéines contrôlent des changements dans les programmes transcriptionnels qui se produisent au cours de la maladie. 6 Dans les pays développés monde, les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité pour les hommes et les femmes 7. Regard sur la façon dont les protéines nucléaires coopèrent pour réguler la progression de cette maladie est essentielle pour faire avancer le traitement actuel options.
La spectrométrie de masse est l'outil idéal pour répondre à ces questions car elle permet une annotation non biaisée de la quantification nucléaire protéome et relative de la façon dont l'abondance de ces protéines varie avec la maladie. Bien qu'il y ait eu plusieurs études protéomiques pour des complexes de protéines de mammifères nucléaires, 8-13 jusqu'à récemment 14, on a eu qu'une seule étude portant sur le protéome cardiaque nucléaire, et considéré comme le noyau entier, plutôt que d'explorer le protéome au niveau des compartiments nucléaires sous 15. En grande partie, ce manque de travail est due à la difficulté d'isoler les noyaux cardiaque. Noyaux cardiaque ultérieure dans un semi-rigide et dense actine-myosine l'appareil auquel ils sont reliés par plusieurs extensions du réticulum endoplasmique, dans la mesure où la contraction des myocytes modifie leur forme générale. 16 En outre, les cardiomyocytes sont 40% en volume 17 mitochondries qui necessitàTES enrichissement du noyau mis à part les autres organites. Ici, nous décrivons un protocole d'enrichissement nucléaire cardiaque et un fractionnement supplémentaire en compartiments biologiquement pertinentes. En outre, nous avons détail les méthodes pour le label sans dissection spectrométrie de masse quantitative de ces fractions des techniques qui se prêtent à l'expérimentation in vivo dans divers modèles animaux et des systèmes d'organes où marquage métabolique n'est pas réalisable.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deux principales méthodes d'isolement nucléaire ont été examinés précédemment: 27 on est la technique d'homogénéisation Behrens tissu lyophilisé dans un solvant non aqueux et le second, une modification, dont nous utilisons ici, d'homogénéisation des tissus dans une solution aqueuse de saccharose / solution saline suivie par différence de densité ou à gradient de centrifugation.
Sous-fractionnement des noyaux par extraction à l'acide sur des échant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le laboratoire Vondriska est financée par des subventions de l'Institut National Heart, Lung and Blood du NIH et la Fondation Laubisch à l'UCLA. EM est destinataire de la Jennifer S. Buchwald bourse d'études supérieures en physiologie à l'UCLA; HC est le destinataire d'un American Heart Association pré-doctoral, le député est le récipiendaire d'une NIH Ruth Kirschstein post-doctoral, et SF est le récipiendaire du une NIH K99 Award.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | |
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | |
| Oriole | BioRad | 161-0496 |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
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