Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia
Summary
I progressi nella spettrometria di massa hanno permesso l'analisi ad alta velocità di espressione della proteina e la modifica in una miriade di tessuti. In combinazione con frazionamento subcellulare e modelli di malattia, di massa quantitativa spettrometria e bioinformatica può rivelare nuove proprietà nei sistemi biologici. Il metodo qui descritto analizza cromatina proteine associate alla regolazione di malattie cardiache ed è facilmente applicabile ad altre<em> In vivo</em> Modelli di malattie umane.
Abstract
Nel nucleo risiedono le proteomi le cui funzioni sono più intimamente collegati con regolazione genica. Adulto nuclei cardiomiociti mammiferi sono unici a causa della elevata percentuale di cellule binucleated, 1 lo stato prevalentemente eterocromatico del DNA, e la non divisione natura del cardiomiociti che rende nuclei adulto in uno stato permanente di interfase. 2 Regolazione trascrizionale durante lo sviluppo e la malattia sono stati ben studiati in questo organo, 3-5 ma ciò che rimane relativamente inesplorato è il ruolo svolto dalle proteine nucleari responsabili per il confezionamento del DNA e di espressione, e di come queste proteine controllare i cambiamenti nei programmi trascrizionali che si verificano durante la malattia. 6 Nella sviluppato mondo, la malattia di cuore è la causa numero uno di mortalità sia per gli uomini e le donne. 7 Insight su come proteine nucleari cooperano per regolare la progressione di questa malattia è fondamentale per far progredire l'attuale trattamento opzioni.
La spettrometria di massa è lo strumento ideale per affrontare queste domande in quanto permette una annotazione imparziale della quantificazione nucleare proteoma e relativo per come l'abbondanza di queste proteine cambiamenti con la malattia. Mentre ci sono stati diversi studi di proteomica per mammiferi complessi proteici nucleari, 8-13 fino a poco tempo 14 vi è stato un solo studio che esamina la proteoma cardiaco nucleare, ed è considerato il nucleo intero, piuttosto che esplorare il proteoma a livello di compartimenti sub nucleari . 15 In gran parte, questa carenza di lavoro è dovuta alla difficoltà di isolare nuclei cardiaca. Nuclei cardiaca avvenire entro un rigido e denso actina-miosina dell'apparecchio a cui sono collegati tramite estensioni multiple dal reticolo endoplasmatico, nella misura in cui altera contrazione miociti loro forma complessiva. 16 Inoltre, cardiomiociti sono il 40% in volume mitocondri 17 che necessitates arricchimento del nucleo parte le altri organelli. Qui si descrive un protocollo per cardiaca arricchimento nucleare e ulteriore frazionamento in compartimenti biologicamente rilevanti. Inoltre, i metodi di dettaglio per l'etichetta senza dissezione massa quantitativa spettrometria di queste frazioni-tecniche suscettibili di sperimentazione in vivo in vari modelli animali e sistemi di organi in cui marcatura metabolica non è fattibile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Due metodi principali per isolamento nucleare sono stati esaminati in precedenza: 27 uno è la tecnica di omogeneizzazione Behrens tessuto liofilizzato in un solvente non acquoso e la seconda, una modifica che usiamo qui, omogeneizzazione di tessuto in una soluzione acquosa di saccarosio / soluzione salina seguita dal differenziale o centrifugazione in gradiente di densità.
Subfractionation dei nuclei mediante estrazione acido su campioni di tessuto è uno strumento importante pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il laboratorio Vondriska è supportato anche da finanziamenti del National Institute Heart, Lung e il Sangue del NIH e la Fondazione Laubisch alla UCLA. EM è destinatario del S. Jennifer Buchwald Graduate Fellowship in Fisiologia presso la UCLA, HC è il destinatario di un American Heart Association Pre-dottorato, MP è il destinatario di un Ruth NIH Kirschstein post-dottorato, e SF è il destinatario di un NIH K99 Award.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | |
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | |
| Oriole | BioRad | 161-0496 |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
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