Avanços na espectrometria de massa permitiu a análise de alto rendimento de expressão da proteína e da modificação de uma série de tecidos. Combinada com fraccionamento subcelular e modelos de doença, a massa espectrometria quantitativa e bioinformática pode revelar novas propriedades nos sistemas biológicos. O método aqui descrito analisa cromatina proteínas associadas na definição de doença cardíaca e é prontamente aplicável a outras<em> In vivo</em> Modelo de doenças humanas.
No núcleo residem os proteomas cujas funções são mais intimamente ligada com a regulação dos genes. Núcleos de cardiomiócitos de mamíferos adultos são únicos, devido à alta porcentagem de células binucleadas, um estado predominantemente heterocromático do DNA, ea natureza não-divisão da cardiomiócitos que torna núcleos de adultos em um permanente estado de interfase. Regulação transcricional 2 durante o desenvolvimento e doença têm sido bem estudado neste órgão, 3-5 mas que continua a ser relativamente pouco explorado o papel desempenhado pelas proteínas nucleares responsáveis pela embalagem de ADN e de expressão, e como estas proteínas controlar alterações em programas de transcrição que ocorrem durante a doença. 6 No desenvolvido mundo, a doença cardíaca é a causa número um de morte para homens e mulheres. 7 dicas sobre como proteínas nucleares cooperar para regular a progressão da doença é fundamental para o avanço do atual tratamento oPÇÕES.
Espectrometria de massa é a ferramenta ideal para abordar estas questões, pois permite uma anotação imparcial da quantificação nuclear proteoma e relativo como a abundância destas proteínas mudanças com a doença. Embora tenha havido vários estudos proteômicos para mamíferos complexos proteicos nucleares, 8-13, até recentemente, 14, tem havido apenas um estudo examinando o proteoma nuclear cardíaco, e é considerado todo o núcleo, em vez de explorar o proteoma ao nível dos sub compartimentos nucleares . 15 Em grande parte, esta falta de trabalho é devido à dificuldade de isolar núcleos cardíaca. Núcleos cardíaco ocorrem dentro de uma superfície rígida e densa aparelho actina-miosina ao qual estão ligados através de várias extensões do retículo endoplasmático, na medida em que se altera a contração do miócito sua forma geral. 16 Além disso, os cardiomiócitos são de 40%, em volume, 17 mitocôndrias que necessitates enriquecimento do núcleo além dos outros organelos. Aqui nós descrevemos um protocolo de enriquecimento nuclear cardíaca e fraccionamento em compartimentos biologicamente relevantes. Além disso, os métodos detalhados para a etiqueta livre de dissecção de massa espectrométrica quantitativa destas fracções-técnicas passíveis de experimentação in vivo em vários modelos animais e sistemas de órgãos, onde marcação metabólica não é viável.
Dois principais métodos para o isolamento nuclear foram revistas anteriormente: 27 um é a técnica de homogeneização Behrens tecido liofilizado num solvente não-aquoso e a segunda, uma modificação do que se usar aqui, de homogeneização de tecidos em uma solução aquosa de sacarose / solução salina seguido pelo diferencial ou gradiente de densidade de centrifugação.
Subfractionation dos núcleos por extracção em meio ácido, em amostras de tecidos é uma ferramenta …
The authors have nothing to disclose.
O laboratório Vondriska é apoiado por subsídios do Instituto do Coração, Pulmão e Sangue Nacional do NIH e da Fundação Laubisch na UCLA. EM é destinatário da S. Jennifer Buchwald de Pós-Graduação Sociedade de Fisiologia na UCLA; HC é o destinatário de um American Heart Association Irmandade Pré-doutoramento; MP é o destinatário de um Kirschstein Ruth NIH bolsa de pós-doutorado, e SF é o destinatário de uma NIH K99 Award.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 |
Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 |
100 μm strainer | BD Falcon | 352360 |
Ultracut ultramicrotome | Reichert | |
100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | |
Oriole | BioRad | 161-0496 |
Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 |
Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 |
Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 |
BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 |
Tubulin antibody | Sigma | T1568 |
Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 |
Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 |
SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 |
E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 |
Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 |
Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 |
BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 |
Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 |
BioWorks Browser | Thermo Scientific |