Kvantitativ analys av kromatin proteom vid sjukdom
Summary
Framsteg inom masspektrometri har tillåtit hög genomströmning analys av proteinuttryck och modifiering i en mängd vävnader. Kombinerat med subcellulär fraktionering och modeller sjukdom, kvantitativ masspektrometri och bioinformatik kan avslöja nya egenskaper i biologiska system. Det häri beskrivna förfarandet analyserar kromatin-associerade proteiner i inställningen av hjärtsjukdomar och är lätt tillämpas på andra<em> In vivo</em> Modeller av mänsklig sjukdom.
Abstract
I kärnan bor på proteom vars funktioner är mest intimt förknippade med genreglering. Vuxen däggdjur cardiomyocyte kärnor är unika på grund av den höga andelen binucleated celler, 1 den övervägande heterochromatic tillstånd DNA, och icke delande natur cardiomyocyte som gör vuxna kärnor i ett permanent tillstånd av interfas. 2 Transkriptionsreglering under utveckling och sjukdom har studerats i detta organ, 3-5, men det som återstår relativt outforskat är den roll som spelas av nukleära proteiner som är ansvariga för DNA-förpackning och uttryck och hur dessa proteiner kontrollerar förändringar i transkriptionella program som inträffar under sjukdom. I utvecklade 6 världen är hjärtsjukdom den vanligaste dödsorsaken för både män och kvinnor. 7 insikt om hur kärnproteiner samverkar för att reglera utvecklingen av denna sjukdom är avgörande för att föra den aktuella behandlingen o= Val.
Masspektrometri är det perfekta verktyget för ta itu med dessa frågor, eftersom det möjliggör en opartisk anteckning av kärn proteomet och relativa kvantifiering för hur överflöd av dessa proteiner förändras med sjukdom. Även om det har gjorts flera proteomik studier för däggdjur nukleära proteinkomplex, 8-13 tills nyligen 14 har det varit bara en studie för att undersöka hjärtats nukleära proteom, och det ansåg hela kärnan, snarare än att utforska proteomet i nivå med nukleära sub fack . 15 Till stor del är denna brist på arbete på grund av svårigheten att isolera hjärt kärnor. Hjärt kärnor sker inom en styv och tät aktin-myosin apparat som de är anslutna via flera förlängningar från det endoplasmatiska retiklet, i den utsträckning som myocyt kontraktion förändrar deras totala form. 16 Dessutom, kardiomyocyter är 40% mitokondrier volym 17 vilken necessitaTES anrikning av kärnan bortsett från de andra organeller. Här beskriver vi ett protokoll för hjärt anrika uran och ytterligare fraktionering i biologiskt relevanta delar. Dessutom har vi detalj metoder för märkning utan kvantitativa masspektrometrisk dissektion av dessa fraktioner-tekniker som lämpar sig för in vivo-experiment i olika djurmodeller och organsystem där metabolisk märkning inte är möjlig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Två huvudsakliga metoder för kärn isolering har granskats tidigare: 27 en är Behrens teknik homogenisering lyofiliserat vävnad i ett icke-vattenhaltigt lösningsmedel och andra, en modifiering som vi använder här, homogenisering vävnad i en vattenbaserad sackaros / saltlösning följt genom differentiell eller densitet-centrifugering.
Subfraktionering av kärnorna genom syraextraktion på vävnadsprov är ett viktigt verktyg för att studera kromatin som har använts sedan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den Vondriska Lab stöds av anslag från National Heart, Lung and Blood Institute av NIH och Laubisch Endowment vid UCLA. EM är mottagare av Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship i fysiologi vid UCLA, HC är mottagare av ett American Heart Association doktorander Fellowship, MP är mottagare av en NIH Ruth Kirschstein postdoktorala stipendiet, och SF är mottagare av en NIH K99 Award.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | |
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | |
| Oriole | BioRad | 161-0496 |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
- Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
- Molkentin, J. D., Dorn, G. W. Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
- Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R., Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
- Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
- Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
- Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
- Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
- Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
- Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
- Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
- Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
- Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
- Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
- Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
- Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
- Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
- Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
- Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
- Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
- Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
- Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
- Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
- Wu, C., et al. A protease for ‘middle-down’ proteomics. Nat. Methods. , (2012).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).
