Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz
Summary
Kütle spektrometresi gelişmeler dokuların bir dizi protein ifade ve modifikasyon yüksek verimlilik analizi sağladı. Subselüler fraksiyonasyon ve hastalık modelleri, spektrometresi ve biyoinformatik biyolojik sistemlerde yeni özellikleri ortaya çıkarabilir nicel kitle ile birlikte. Burada açıklanan yöntem, kalp hastalığı arasında bir ortamda kromatin ilişkili proteinlerin analiz eder ve diğer kolayca uygulanabilir<em> In vivo</em> Insan hastalık modelleri.
Abstract
Çekirdeğin içinde olan fonksiyonlar en yakından gen regülasyonu ile bağlantılı proteomlarda bulunur. Erişkin memeli kardiyomiyosit çekirdeklerinin nükleuslu hücrelerin oranı yüksek, 1 DNA ağırlıklı heterokromatik durumu nedeniyle benzersizdir ve geliştirme sırasında interfaz kalıcı bir devlet yetişkin çekirdekleri işler kardiyomiyosit-olmayan bölünmesi doğası. 2 Transkripsiyonal düzenleme ve Hastalığın sıra bu proteinlerin hastalığı sırasında meydana transkripsiyonel programları değişiklikleri kontrol nasıl bu organ, 3-5 okudu ama ne nispeten keşfedilmemiş kalır DNA paketlenmesi ve ifade sorumlu nükleer proteinler oynadığı rol ve oylandı. 6 geliştirilen yılında dünya, kalp hastalığı erkekler hem de kadınlar için ölüm bir numaralı nedenidir. nükleer proteinleri bu hastalığın ilerlemesini düzenleyen işbirliği nasıl 7 Insight güncel tedavi o ilerleyen için kritikeçenekler.
Kütle spektrometresi bu hastalıkla nasıl bu proteinlerin bolluğu değişiklikler için nükleer proteom ve göreli kantifikasyon tarafsız bir açıklama sağlayan bu soruların iletilebileceği ideal bir araçtır. Son zamanlara kadar memeli nükleer protein kompleksleri, 8-13 için çeşitli proteomik çalışmalar varken 14 kardiyak nükleer proteom inceleyen sadece bir çalışma olmuştur ve oldukça nükleer alt bölmeleri düzeyinde proteom keşfetmek yerine, tüm çekirdek olarak kabul . Büyük bir kısmı 15, bu iş sıkıntısı kardiyak çekirdeklerin tecrit zorluk kaynaklanmaktadır. Kardiyak çekirdekler miyosit daralma değiştiren kendi genel şekli. 16 Ayrıca, kardiyomiyositlerde hacmi 17 ile% 40 mitokondri olduğu ölçüde, onlar endoplazmik retikulum birden uzantıları aracılığıyla bağlı bir katı ve yoğun aktin-miyozin aygıtı içinde ortaya çıktığı Necessitadiğer organeller dışında çekirdeğin zenginleştirme tes. Burada biyolojik ilgili bölmeye kardiyak nükleer zenginleştirme ve daha fazla fraksiyonasyon için bir protokol açıklar. Ayrıca, metabolik etiketleme mümkün değildir çeşitli hayvan modelleri ve organ sistemleri in vivo deneyler için mükellef bu fraksiyonların-teknikleri etiketi ücretsiz kantitatif kütle spektroskopisi diseksiyon için detaylı yöntemleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nükleer izolasyonu için iki temel yolu önceden gözden geçirilmiştir: 27 tek bir sulu sakaroz / tuz çözeltisi içinde doku homojenleştirici bir sulu olmayan çözücü içinde liyofilize doku homojenleştirici arasında Behrens teknik ve ikinci olarak, burada kullanımı olan bir değişiklik, bir izlenen diferansiyel veya yoğunluk gradiyenti santrifüj yoluyla.
Doku örnekleri asit ekstraksiyon ile çekirdeklerin Subfractionation histon analiz olmanın orijinal amacı il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vondriska laboratuar NIH ve UCLA Laubisch Endowment Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibe tarafından desteklenmektedir. EM UCLA Fizyoloji Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship alıcısı olduğunu; HC Amerikan Kalp Derneği Pre-doktora bursu sahibidir; MP bir NIH Ruth Kirschstein Doktora Sonrası Bursu alıcı olması ve SF alıcısı bir NIH K99 Ödülü.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | |
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | |
| Oriole | BioRad | 161-0496 |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
- Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
- Molkentin, J. D., Dorn, G. W. Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
- Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R., Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
- Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
- Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
- Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
- Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
- Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
- Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
- Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
- Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
- Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
- Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
- Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
- Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
- Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
- Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
- Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
- Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
- Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
- Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
- Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
- Wu, C., et al. A protease for ‘middle-down’ proteomics. Nat. Methods. , (2012).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).
