Murine Norovirus के लिए पट्टिका परख

Summary

यहाँ हम एक murine (MNV) norovirus, जो केवल norovirus कि कुशलतापूर्वक सेल संस्कृति में replicates है संक्रामक कणों यों विधि का वर्णन है. पट्टिका परख murine मैक्रोफेज के लिए MNV tropism का लाभ लेता है और जैविक या पर्यावरण MNV युक्त नमूने के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Abstract

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture ^{1, 2}. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages ¹. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay ¹. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques ³.

Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay ³, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers ⁴. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID₅₀) ³. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration ⁵. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay ⁴.

In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples ^{1, 4, 6}. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample ³.

Protocol

1. बृहतभक्षककोशिका सेल 264.7 रॉ रेखा के संवर्धन DMEM 10-मीडिया में कच्चे 264.7 कोशिकाओं (ATCC, सूची # TIB 71), जो 10 (v / v)% कम endotoxin भ्रूण गोजातीय सीरम (<10 यूरोपीय संघ > नोट: यह सलाह दी जाती है autoclaved SeaPlaque agarose साथ कई बोतलें समय से आगे तैयार. Agarose किया जा सकता है का उपयोग करने से पहले एक माइक्रोवेव में फिर से पिघल. उपरिशायी प्लेटों की कुल मात्रा के लिए आवश्यक से पहले 1 घंटे ऊष्मायन पूरा हो गया है की राशि की गणना. जरूरत मात्रा 2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से या 12 ml/6-well प्लेट है. Agarose (3.2 अनुभाग देखें) और मीडिया (3.3 अनुभाग देखें) अलग से तैयार करो. Agarose तैयार करते हैं, एक कांच की बोतल में आसुत जल (3% w / v) की 100 मिलीलीटर की कुल मात्रा में 3 SeaPlaque agarose के जी को स्थगित कर देते हैं. 20-30 मिनट के लिए आटोक्लेव. (यदि agarose पहले से ही हाथ, फिर से पिघल माइक्रोवेव में agarose से पहले तैयार किया गया था.) यह महत्वपूर्ण है 42 ° C उपयोग करने से पहले एक पानी में स्नान क्योंकि अगर agarose भी गर्म है, यह कोशिकाओं को मारने जाएगा SeaPlaque agarose संतुलन में लाना. सुनिश्चित करें कि जल स्तर के लिए या ऊपर agarose अवांछित solidification से बचने के स्तर के बराबर है. करने के लिए मीडिया को तैयार: 2x सदस्य मीडिया, जो होते हैं की 100 मिलीलीटर2x सदस्य, 10% (v / v) कम endotoxin भ्रूण गोजातीय सीरम (<10 यूरोपीय संघ >

Discussion

MNV-1 के लिए पट्टिका परख विधि यहाँ प्रस्तुत बढ़ाता संक्रामक MNV कणों का एक तरीका है. परख 3 चित्र में सचित्र चरणों का अनुसरण करके, एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वायरल titers प्राप्त कर सकते हैं. परख का पता लगाने की सीमा शुरू कमजोर पड़ने पर निर्भर करता है. जब नमूना ऊपर वर्णित के रूप में एक 1:10 कमजोर पड़ने के साथ शुरू, पट्टिका परख का पता लगाने की सीमा pfu 10 (यानी, 1 10 ^-1 कमजोर पड़ने पर दिखाई पट्टिका) है. चूंकि प्रत्येक पट्टिका एक वायरस का प्रतिनिधित्व करता है, पट्टिका परख भी अलग सजीले टुकड़े उठा और प्रचार के रूप में उन्हें ^एक पहले से वर्णित MNV की clonal आबादी को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, पट्टिका Purifications भी मिश्रित वायरस आबादी से एक व्यक्ति वायरस आबादी को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. MNV संक्रमण का पता लगाने के लिए एक पट्टिका परख का उपयोग की एक सीमा है कि सभी MNV नहीं उपभेदों सजीले टुकड़े फार्म ^4. हालांकि, यह संभव हो सकता inabili दूर कर सकते हैंty कुछ MNV उपभेदों, जानवरों से अलग, serially ऊतक संस्कृति ⁷ में इन वायरस passaging सजीले टुकड़े के रूप में की. पट्टिका परख के लिए एक विकल्प के लिए TCID ₅₀ ^{3 तकनीक, 4} के माध्यम से संक्रामक कणों को मापने के लिए है. इस परख वायरस की राशि inoculated ऊतक endpoint dilutions और 1 सप्ताह लेता ⁴ MNV के लिए पूरा के बाद संस्कृति कोशिकाओं के 50% में CPE का निर्माण करने के लिए आवश्यक quantifies. एक पट्टिका परख की तुलना में धीमी होने के अलावा, TCID ₅₀ परख भी संवेदनशील के रूप में नहीं है (पता लगाने की सीमा = 200 TCID ₅₀ मिलीग्राम /) ऊतकों के नमूनों की रॉ 264.7 ⁴ कोशिकाओं को विषाक्तता के कारण.

हालांकि प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल भर में वर्णित किया गया है, निम्न अनुभाग एक सारांश के लिए मुसीबत शूटिंग की सुविधा प्रदान करता है. प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि रॉ 264.7 कोशिकाओं वायरस प्रतिकृति का समर्थन परख भर में व्यवहार्य रहना है. यह कर सकते हैंप्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से परख के प्रत्येक चरण पर नजर रखी. सेल व्यवहार्यता दो मायनों में यह सुनिश्चित किया है. सबसे पहले, ध्यान नहीं जाने के लिए कोशिकाओं को बाहर सूख जबकि प्लेटों से निपटने के लिए लिया जाना चाहिए. इस प्रकार, प्लेटें एक समय में एक inoculated हैं, संक्रमण अवधि के दौरान हिलाकर रख दिया, और रहते हैं जब भी वे नहीं संभाला जा रहा है कर रहे हैं बंद कर दिया जाना चाहिए. दूसरा, समाधान कोशिकाओं पर जोड़ा ~ 37 ° सी. equilibrated होना चाहिए इसके अलावा, यह रॉ 264.7 कोशिकाओं के समग्र स्वास्थ्य के लिए उन्हें कम endotoxin सीरम (<10 यूरोपीय संघ / एमएल) है, जो कोशिकाओं की सक्रियता सीमा वाले मीडिया में बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, हम एक उच्च पट्टिका परख की असफलता की दर मनाया है जब 30 मार्ग या अधिक से कोशिकाओं का उपयोग कर रहा है. हालांकि इस संभावना प्रयोगशाला से प्रयोगशाला के लिए अलग अलग होंगे, यह महत्वपूर्ण है के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं (उदाहरण के लिए, एक ज्ञात वायरल titer साथ एक नमूना) प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य titers सुनिश्चित करने के लिए, खासकर जब उच्च बीतने के रॉ 264.7 कोशिकाओं का उपयोग. उच्च बीतने के कोशिकाओं के उपयोग को सीमित करने के लिए, यह सलाह दी जाती है जल्दी Passa की शीशियों फ्रीजरॉ 264.7 कोशिकाओं की रसीद और जमे हुए शीशियों से एक नई संस्कृति अक्सर शुरू पर जीई कोशिकाओं. कम बीतने के सेल संस्कृतियों के साथ शुरू में भी सहायक हो सकता है जब कोशिकाओं प्रदर्शन का पालन करना, सेल आकारिकी में परिवर्तन (पतली दौर से जैसे और बाहर फैल) विफलता के रूप में बदल विशेषताओं, या जब mycoplasma संदूषण का पता चला गया है. एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु को ध्यान देना करने के लिए सुनिश्चित करें कि विंदुक युक्तियाँ नमूनों के बीच और dilutions दौरान बदल रहे हैं. यह सही धारावाहिक dilutions सुनिश्चित करने के लिए और नमूने के बीच पार संदूषण को रोकने जाएगा. प्रोटोकॉल जहां एक ही विंदुक टिप फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है में एक कदम है जब एक ही नमूना के धारावाहिक dilutions कुओं को जोड़ रहे हैं. उस मामले में, एक सबसे पतला inoculum से कम से कम करने के लिए शुरू करना चाहिए और सख्ती पिपेट और नीचे जब एक नई कमजोर पड़ने ड्राइंग.

पट्टिका परख प्रोटोकॉल में कई संशोधनों को संशोधनीय है. एक संशोधन है कि टी जब बनाया जा सकता हैयहाँ दो प्रतियों में कुओं inoculating के लिए पर्याप्त कोशिकाओं नहीं कर रहे हैं प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए केवल एक ही अच्छी तरह से टीका लगाना है. हालांकि, बाद से inoculum मात्रा 0.5 मिलीग्राम है, सजीले टुकड़े की संख्या तो pfu / मिलीलीटर के लिए मानक के अनुसार 2 की एक कारक से गुणा किया की जरूरत है. पट्टिका परख भी किसी अन्य पक्षपाती सेल लाइन है कि MNV की प्रतिकृति का समर्थन करने में सक्षम है के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और इस murine microglial BV-2 कोशिका ⁸ लाइन के लिए वर्णित किया गया है. अन्य संशोधनों के लागू किया जा सकता है कि रूपांतरों कि पट्टिका परख अन्य वायरस के लिए विकसित प्रोटोकॉल के लिए वर्णित किया गया है. MNV के मामले में निम्न संशोधन पहले से ही सफलतापूर्वक लागू किया गया है, मिथाइल सेलूलोज सागर फलक की बजाय ⁹ agarose, और कोशिकाओं के क्रिस्टल बैंगनी या तटस्थ लाल ^{10, 11} के बजाय नीले methylene साथ धुंधला हो जाना का उपयोग करें.

कुल मिलाकर, यह आसानी से प्रोटोकॉल के रूप में अन्य पट्टिका गठन वायरस यों की जरूरत है या अन्य संगठनों के लिए इस्तेमाल किया अनुकूलित किया जा सकता हैएर वायरस है कि रॉ 264.7 कोशिकाओं में lytic संक्रमण के कारण, यह सामान्य में संक्रामक वायरल कणों यों के लिए एक उपयोगी उपकरण बना रही है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM/ High glucose	Hyclone	SH30243.02
2x MEM	Gibco	11935
100x Penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010
10 mM Non-essential amino acids	Hyclone	SH30238.01
1M HEPES	Hyclone	SH30237.01
200 mM (100x) L-glutamine	Hyclone	SH30034.01
Fetal Bovine Serum	Gibco, Hyclone	10437, SH30070.02
Sea Plaque Agarose	Lonza	50100
Neutral Red 0.33%	Sigma	N2889
1x PBS	Gibco	10010
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
Model 35 Speed Rocker	Labnet	S2035
Magna Lyser Instrument	Roche	03358968001
Raw 264.7 cell line	ATCC	TIB-71
Tissue culture incubator	Sanyo	MCO-18AIC