Plaque assay voor Murine Norovirus

Summary

Hier beschrijven we een methode om infectieuze deeltjes van murine norovirus (MNV), de enige norovirus die efficiënt repliceert in celkweek kwantificeren. De plaque assay maakt gebruik van tropisme MNV voor murine macrofagen en kan worden aangepast voor gebruik met biologische of milieumonsters met MNV.

Abstract

Murine Norovirus (MNV) is het enige lid van de Norovirus geslacht die efficiënt groeit in weefselkweek ^{1, 2.} Cellysis en cytopathische effect (CPE) worden waargenomen tijdens MNV-1 infectie van murine dendritische cellen of macrofagen ^1. Deze eigenschap van MNV-1 kan worden gebruikt om het aantal van infectieuze deeltjes in een monster te kwantificeren door het uitvoeren van een plaque assay ^1. De plaque assay gebaseerd op het vermogen van MNV-1 cellen te lyseren en gaten vormen in een confluente monolaag van cellen, de zogenaamde plaques ^3.

Meerdere technieken kunnen worden gebruikt om virale infecties te detecteren in weefselkweek, geoogst weefsel, klinische en milieumonsters, maar niet alle meten het aantal infectieuze deeltjes (bijvoorbeeld qRT-PCR). Een manier om infectieuze virusdeeltjes kwantificeren is via een plaque assay ^3, die hieronder zal worden beschreven in detail. Een variatie op de MNV plaque assay is de fluorescent nadruk assay, waarbij MNV antigeen immunogekleurd in celmonolagen ^4. Deze test kan sneller, omdat viraal antigeen expressie voorafgaat plaquevorming. Het is ook nuttig voor titreren virussen geen plaques vormen. De nadruk fluorescent assay vereist aanvullende middelen dan die van de plaque assay, zoals antilichamen en een microscoop voor focus-vormende eenheden telt. Infectieuze MNV kan ook worden gekwantificeerd door bepaling van de 50% Tissue Culture infectieuze dosis _(TCID50) ^3. Deze test meet de hoeveelheid virus vereist om CPE in 50% produceren voedingsbodem weefselkweekcellen door titratie eindpunt ^5. Echter, de detectiegrens is hoger dan een plaque assay ^4.

In dit artikel beschrijven we een plaque assay protocol dat gebruikt kan worden om feite het aantal infectieuze MNV deeltjes aanwezig in biologische of milieumonsters ^{1, 4, 6.} Deze methode is based de bereiding van 10-voudige seriële verdunningen van MNV bevattende monsters, die gebruikt worden om een ​​monolaag van permissieve cellen (RAW 264.7 muis macrofaagcellen) te inoculeren. Virus mag aan de celmonolaag hechten gedurende een bepaalde tijd en vervolgens afgezogen voor die cellen met een mengsel van agarose en celkweekmedia. De agar maakt de verspreiding van virale nakomelingen naar naburige cellen terwijl het beperken van verspreiding naar de verte gelegen cellen. Bijgevolg worden geïnfecteerde cellen gelyseerd en vorm gaten in de monolaag plaques genoemd. Bij voldoende spreiding van virus, plaques zichtbaar volgende kleuring van cellen met kleurstoffen, zoals neutraal rood, methyleenblauw of kristalviolet. Bij lage verdunningen, elke plaque afkomstig is van een besmettelijke virale deeltje en zijn nakomelingen, die verspreid naar naburige cellen. Zo tellen van het aantal plaques kan men berekenen plaque-vormende eenheden (PFU) in het onverdunde monster ^3.

Protocol

1. Kweken van de macrofaagcellijn RAW 264.7 Handhaven RAW 264.7 cellen (ATCC, catalogus # TIB-71) in DMEM-10 media, die hoge glucose DMEM bestaat met 10% (v / v) laag-endotoxine foetaal bovine serum (<10 eu > Let op: het is aan te raden om meerdere flessen met geautoclaveerd SeaPlaque agar, van tevoren. Agarose kan opnieuw gesmolten in een magnetron voor gebruik. Bereken de hoeveelheid overlay benodigd voor het totale volume van platen voor 1 uur incubatie is voltooid. De benodigde volume is 2 ml / putje of 12 ml/6-well plaat. Bereid agarose (zie paragraaf 3.2) en de media (zie paragraaf 3.3) afzonderlijk. De agarose bereiden schorsen 3 g SeaPlaque agarose in een totaal volume van 100 ml gedestilleerd water (3% w / v) in een glazen fles. Autoclaaf gedurende 20-30 min. (Als agarose reeds tevoren bereid, re-melt agarose in magnetron.) Het is belangrijk SeaPlaque agarose equilibreren tot 42 ° C in een waterbad voor gebruik want als de agarose te heet, zal doden cellen. Zorg ervoor dat het waterpeil gelijk is aan of boven het niveau van de agarose om ongewenste stolling te voorkomen. De media bereiden: maak 100 ml 2x MEM media, bestaande uit2x MEM, 10% (v / v) laag-endotoxine foetaal bovine serum (<10 eu >

Discussion

De plaque assay methode voor het MNV-1 hier gepresenteerde is een manier van kwantificeren besmettelijke MNV deeltjes. Door de assay stappen in fig. 3 verkrijgt men reproduceerbaar virale titers. De detectiegrens van de test afhankelijk van de gebruikte uitgangsmaterialen verdunning. Bij het ​​starten met een 1:10 verdunning van monster zoals hierboven beschreven, de detectiegrens van de plaque assay is 10 pfu (dwz 1 plaque zichtbaar op 10 ^-1 verdunning). Aangezien elke plaque vertegenwoordigt een virus kan de plaque assay worden gebruikt om klonale populaties van MNV zuiveren door plukken geïsoleerde plaques en teeltmateriaal ze als eerder beschreven ^1. Daarnaast kan plaquezuiveringen ook worden gebruikt om een ​​individueel viruspopulatie scheiden van gemengde populaties virus. Een beperking van het gebruik van een plaque assay voor de detectie van MNV infectie is dat niet alle stammen MNV vormen plaques ^4. Het kan echter mogelijk zijn de inabili overwinnenty van sommige MNV stammen, geïsoleerd uit dieren, tot plaques te vormen door serieel passage deze virussen in weefselkweek ^7. Een alternatief voor de plaque assay is het meten van infectieuze deeltjes via de _TCID50 techniek ^{3, 4.} Deze assay kwantificeert de hoeveelheid virus vereist om CPE in 50% produceren voedingsbodem weefselkweekcellen na eindpunt verdunningen en duurt 1 week te vullen voor MNV ^4. Naast het feit dat langzamer dan een plaque assay, de TCID ₅₀ assay is niet zo gevoelig (detectielimiet = 200 _TCID50 / ml) door de toxiciteit van weefselmonsters te RAW 264.7 cellen ^4.

Hoewel kritische stappen in het protocol zijn beschreven in heel het protocol worden de volgende sectie vindt u een overzicht aan trouble shooting vergemakkelijken. De belangrijkste stap in het protocol is dat RAW 264.7 cellen levensvatbaar blijven gedurende de test om virusreplicatie te ondersteunen. Dit kanworden gecontroleerd in elk stadium van de assay via lichtmicroscopie. Levensvatbaarheid van de cellen is gewaarborgd twee manieren. Ten eerste moet erop worden gelet niet te laten cellen uitdrogen tijdens het hanteren van platen. Aldus worden de platen geënt met een tegelijk, geschud gedurende infectie periode en blijven gesloten wanneer ze niet worden behandeld. Tweede oplossingen toegevoegd aan cellen moet geëquilibreerd tot ~ 37 ° C. Verder is het van vitaal belang voor de algehele gezondheid van de RAW 264.7 cellen om ze te handhaven in media die lage endotoxine serum (<10 EU / ml), die de activering van cellen beperkt. Bovendien hebben we waargenomen een hoger percentage mislukkingen van de plaque assay bij gebruik van cellen van passage 30 of hoger. Hoewel dit zal waarschijnlijk variëren van lab tot lab, is het belangrijk om een positieve controle omvatten (bijvoorbeeld een monster met een bekende virale titer) reproduceerbaar titers waarborgen, met name bij gebruik van hogere passage RAW 264.7 cellen. Beperken van hogere passage cellen, is het raadzaam om bevriezing flacons eerste passage cellen na ontvangst van RAW 264.7 cellen en start een nieuwe cultuur uit de bevroren flesjes vaak. Starting over met een lage doorgang celculturen zal ook nuttig zijn wanneer de cellen vertonen veranderde kenmerken, zoals het niet in acht, veranderingen in cel morfologie (bijv. van rond tot spichtig en verspreid), of wanneer mycoplasma besmetting is aangetroffen. Een ander belangrijk punt om aandacht te besteden aan is ervoor te zorgen dat de pipetpunten worden gewijzigd tussen monsters en tijdens de verdunningen. Dit zal zorgen voor nauwkeurige seriële verdunningen en het voorkomen van kruisbesmetting tussen de monsters. De een stap in de protocol waarin dezelfde pipetpunt opnieuw kan worden gebruikt wanneer seriële verdunningen van hetzelfde monster worden toegevoegd aan putjes. In dat geval moet worden uitgegaan van de meest verdunde inoculum op zijn zachtst, en krachtig pipetteren op en neer bij het opstellen van een nieuwe verdunning.

De plaque assay protocol is amendeerbaar verschillende wijzigingen. Een wijziging kan worden gemaakt wanneer thier niet genoeg cellen voor enten putjes in duplo is slechts een goed inoculeren voor elke verdunning. Aangezien het inoculum volume is 0,5 ml, het aantal plaques Vervolgens moet worden vermenigvuldigd met een factor 2 tot normaliseren pfu / ml. De plaque assay kan ook worden aangepast voor gebruik met andere hechtende cellijn die in staat is om replicatie van MNV ondersteunen, en dit is beschreven voor de murine microgliacellen BV-2 cellijn ^8. Andere modificaties die kunnen worden toegepast zijn aanpassingen die zijn beschreven voor plaque assay protocollen ontwikkeld voor andere virussen. Bij MNV zijn de volgende wijzigingen reeds met succes toegepast, het gebruik van methylcellulose plaats van Sea Plaque agarose ⁹ en kleuring van cellen met kristalviolet of methyleenblauw in plaats van neutraal rood ^{10, 11.}

Overall, dit protocol gemakkelijk worden aangepast zoals nodig om andere plaquevormende virussen kwantificeren of voor other virussen die lytische infecties in RAW 264.7 cellen veroorzaken, waardoor het een nuttig instrument om infectieuze virale deeltjes in het algemeen te kwantificeren.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM/ High glucose	Hyclone	SH30243.02
2x MEM	Gibco	11935
100x Penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010
10 mM Non-essential amino acids	Hyclone	SH30238.01
1M HEPES	Hyclone	SH30237.01
200 mM (100x) L-glutamine	Hyclone	SH30034.01
Fetal Bovine Serum	Gibco, Hyclone	10437, SH30070.02
Sea Plaque Agarose	Lonza	50100
Neutral Red 0.33%	Sigma	N2889
1x PBS	Gibco	10010
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
Model 35 Speed Rocker	Labnet	S2035
Magna Lyser Instrument	Roche	03358968001
Raw 264.7 cell line	ATCC	TIB-71
Tissue culture incubator	Sanyo	MCO-18AIC