Het visualiseren van Bacteriën in Nematoden met behulp van fluorescentie microscopie

Summary

Om de mutualisme tussen studeren<em> Xenorhabdus</em> Bacteriën en<em> Steinernema</em> Nematoden, methoden ontwikkeld om bacteriële aanwezigheid en locatie binnen nematoden volgen. De experimentele benadering, die kan worden toegepast op andere systemen, houdt techniek bacteriën het groen fluorescent eiwit en visualiseren expressie, met fluorescentiemicroscopie bacteriën in de transparante nematode.

Abstract

Symbiose, het samenleven van twee of meer organismen, zijn wijdverspreid in alle koninkrijken van het leven. Als twee van de meest gebruikte organismen op aarde, nematoden en bacteriën vormen een breed scala van symbiotische associaties die variëren van gunstig pathogene ^1-3. Een van deze vereniging is de wederzijds voordelige relatie tussen Xenorhabdus bacteriën en Steinernema nematoden, die zich ontpopt als een modelsysteem van symbiose ^4. Steinernema nematoden zijn entomopathogene, met behulp van hun bacteriële symbiont te doden insecten ^5. Voor overdracht tussen insect gastheren, de bacteriën koloniseren de darm van besmettelijke de nematode de juveniele fase ^6-8. Onlangs hebben diverse andere nematode species aangetoond bacteriën gebruiken insecten te doden ^9-13, en onderzoeken begonnen onderzoeken van de interacties tussen de nematoden en bacteriën in deze systemen <sup> 9.

We beschrijven een werkwijze voor visualisatie van een bacteriële symbiont in of op een nematode gastheer te maken van de optische transparantie van nematoden wanneer bekeken door microscopie. De bacteriën zijn ontworpen om een ​​fluorescent eiwit tot expressie, zodat de visualisatie met fluorescentiemicroscopie. Veel plasmiden beschikbaar die dragen genen die coderen voor eiwitten die fluoresceren bij verschillende golflengten (bijvoorbeeld rood of groen), en conjugatie van plasmiden van een donor Escherichia coli-stam in een ontvanger bacteriële symbiont is succesvol voor een groot aantal bacteriën. De beschreven methoden zijn ontwikkeld om de associatie tussen Steinernema carpocapsae en Xenorhabdus nematophila ¹⁴ te onderzoeken. Soortgelijke methoden zijn gebruikt om andere nematode-bacterie associaties ^{9, 15-18} onderzoeken en de aanpak derhalve algemeen toepasbaar is.

The Method maakt karakterisering van bacteriële aanwezigheid en lokalisatie binnen nematoden in verschillende stadia van ontwikkeling, het verstrekken van inzicht in de aard van de vereniging en het proces van kolonisatie ^{14, 16, 19.} Microscopische analyse onthult zowel kolonisatie frequentie binnen een populatie en lokalisatie van bacteriën gastheerweefsels ^{14, 16, 19-21.} Dit is een voordeel ten opzichte van andere methoden om bacteriën in nematode populaties, zoals sonicatie ²² of slijpen ^23, welke kan gemiddelde niveau van kolonisatie, maar mag bijvoorbeeld populaties onderscheid met een hoge frequentie van laag symbiont ladingen van populaties met een lage frequentie van hoge belastingen symbiont. Discrimineren de frequentie en belasting van koloniserende bacterie kan vooral van belang bij het ​​screenen of het karakteriseren van bacteriële kolonisatie mutanten fenotypes ^{21, 24.} Inderdaad, fluorescentie microscopie gebruikt in high throughput screening van bacteriële mutanten voor gebreken in kolonisatie ^{17, 18,} ​​en is minder arbeidsintensief dan andere methoden, zoals sonicatie ^{22, 25-27} en individuele nematode dissectie ^{28, 29.}

Protocol

1. Bouw van een TL-bacteriestam via Vervoeging Grow de ontvangende stam (symbiont te onderzoeken) en donorstam 's nachts. De donor stam, gewoonlijk Escherichia coli, moeten kunnen doneren DNA via conjugatie en worden getransformeerd met een plasmide (Tabel 2) dat een gen dat codeert voor een fluorescent eiwit draagt. Afhankelijk van het plasmide kan een conjugatie helper stam ook nodig. Als dat zo is, moet deze stam ook 's nachts worden gekweekt. De donor stam en helper stam …

Discussion

De hier beschreven protocol verschaft een werkwijze voor de optische detectie van bacteriën in een nematode host (figuur 1). Deze methode maakt gebruik van de optische transparantie van nematoden en het vermogen om fluorescent label bacteriën, waardoor in vivo analyse van bacteriën in de nematode host (figuur 3). Bijzonder heeft deze benadering identificeert bacteriële lokalisatie in ontvanger. Door het tellen van een nematodenpopulatie en scores voor bacteriële aanwezighe…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Lipid Agar (sterile)			8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving
Corn Syrup Solution (sterile)			7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave
Egg Solution			16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water
Lysogeny Broth (sterile)			5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave
Microfuge	Fisher	13-100-675	Any microfuge that holds microfuge tubes will work
Centrifuge	Beckman	366802	Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish	Fisher	0875713
50 ml centrifuge tubes	Fisher	05-539-6
15 ml centrifuge tubes	Fisher	05-531-6
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish	Fisher	0875711Z	Deeper than standard Petri dishes
24-well plate	Greiner Bio-One	662000-06
Microscope			The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (sterile)			8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave
Microfuge tubes	Fisher	05-408-138	2 ml or 1.5 ml tubes
Shaker			Any shaker that causes the liquid to gently move will work
Diaminopimelic acid	Sigma	D-1377	If needed, supplement media to a concentration or 1 mM