Å studere mutualism mellom<em> Xenorhabdus</em> Bakterier og<em> Steinernema</em> Nematoder, metoder ble utviklet for å overvåke bakteriell tilstedeværelse og plassering i nematoder. Den eksperimentelle tilnærming, som kan brukes til andre systemer, innebærer tekniske bakterier å uttrykke grønt fluorescerende protein og visualisering, bruker fluorescensmikroskopi bakterier innenfor det gjennomsiktige nematode.
Symbiose, den lever sammen av to eller flere organismer, er utbredt i alle riker av livet. Som to av de mest utbredte organismer på jorden, nematoder og bakterier danner et bredt utvalg av symbiotiske foreninger som spenner fra gunstig for sykdomsfremkallende 1-3. En slik sammenheng er det gjensidig fordelaktig forhold mellom Xenorhabdus bakterier og Steinernema nematoder, som har dukket opp som et modellsystem for symbiose 4. Steinernema nematoder er entomopathogenic, ved hjelp av sin bakteriell symbionten å drepe insekter 5. For overføring mellom insekt verter, bakterier kolonisere tarmen av nematode er infeksiøs yngelstadiet 6-8. Nylig har flere andre nematode arter blitt vist å utnytte bakterier for å drepe insekter 9-13, og undersøkelser har begynt å undersøke interaksjonen mellom nematoder og bakterier i disse systemene <sup> 9.
Vi beskriver en fremgangsmåte for visualisering av en bakteriell symbionten innenfor eller på en nematode vert, å utnytte den optiske transparens av nematoder når sett ved mikroskopi. Bakteriene er konstruert for å uttrykke et fluorescerende protein, slik at deres visualisering av fluorescens mikroskopi. Mange plasmider er tilgjengelig som bærer gener som koder for proteiner som fluorescerer ved forskjellige bølgelengder (dvs. grønn eller rød), og konjugering av plasmider fra en donor Escherichia coli-stamme i en mottaker bakteriell symbionten er vellykket for et bredt spekter av bakterier. Metodene som er beskrevet ble utviklet for å undersøke sammenhengen mellom Steinernema carpocapsae og Xenorhabdus nematophila 14. Liknende metoder har blitt brukt til å undersøke andre nematode-bakterien foreninger 9, 15-18 og tilnærming er derfor gjelder generelt.
The Method tillater karakterisering av bakteriell tilstedeværelse og lokalisering innenfor nematoder på ulike stadier av utviklingen, og gir innsikt i natur foreningen og prosessen med 14 kolonisering, 16, 19. Mikroskopisk analyse avslører både kolonisering frekvens i en populasjon og lokalisering av bakterier som vert vev 14, 16, 19-21. Dette er en fordel fremfor andre metoder for overvåking bakterier innenfor nematode populasjoner som sonikering 22 eller sliping 23, som kan gi gjennomsnittlig nivå av kolonisering, men kan for eksempel ikke, diskriminere populasjoner med en høy frekvens av lavpris Symbiont laster fra populasjoner med en lav frekvens av høye Symbiont belastninger. Diskriminerende frekvens og belastning av koloniserende bakterier kan være spesielt viktig når screening eller karakterisere bakterielle mutanter for kolonisering fenotyper 21, 24. Har faktisk fluorescensmikroskopi blitt brukt i høy gjennomstrømning screening av bakterielle mutanter med defekter i 17 kolonisering, 18, og er mindre arbeidskrevende enn andre metoder, inkludert sonikering 22, 25-27 og individuell nematode disseksjon 28, 29.
Protokollen beskrevet her gir en fremgangsmåte for optisk deteksjon av bakterier i en nematode vert (Figur 1). Denne metoden drar nytte av den optiske transparens av nematoder og evnen til fluorescently label bakterier, slik in vivo analyse av bakterier innenfor nematode verten (Figur 3). Konkret identifiserer denne tilnærmingen bakteriell lokalisering innenfor sin vert. Ved å telle en nematode befolkning og scoring for bakteriell tilstedeværelse, kan frekvensen av bakterie…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Eugenio Vivas, Kurt Heungens, Eric Martens, Charles Cowles, Darby Sugar, Eric Stabb, og Todd Ciche for deres bidrag til utviklingen av denne protokollen og verktøy som brukes. KEM og JMC ble støttet av National Institutes of Health (NIH) National Research Service Award T32 (AI55397 "Mikrober i helse og sykdom"). JMC ble støttet av National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Foundation (IOS-0920631 og IOS-0950873).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Lipid Agar (sterile) |
8 grams nutrient broth, 15 grams agar, 5 grams yeast extract, 890 ml water, 10 ml 0.2 g/ml MgCl2. 6H20, 96 ml corn syrup solution*, 4 ml corn oil* Stir media while pouring plates *add sterile ingredient after autoclaving |
||
Corn Syrup Solution (sterile) |
7 ml corn syrup, 89 ml water mix and autoclave |
||
Egg Solution | 16.6 ml 12% sodium hypochlorite, 5 ml 5M KOH, 80 ml water | ||
Lysogeny Broth (sterile) |
5 grams yeast extract, 10 grams tryptone, 5 grams salt, 1 L water mix and autoclave |
||
Microfuge | Fisher | 13-100-675 | Any microfuge that holds microfuge tubes will work |
Centrifuge | Beckman | 366802 | Large table top centrifuge that holds 15 ml and 50 ml conical tubes |
Sterile 60 mm X 15 mm Petri Dish | Fisher | 0875713 | |
50 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-539-6 | |
15 ml centrifuge tubes | Fisher | 05-531-6 | |
Sterile 100 mm X 20 mm Petri Dish | Fisher | 0875711Z | Deeper than standard Petri dishes |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662000-06 | |
Microscope | The microscope needs florescent capabilities compatible with your fluorophore | ||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
PBS (sterile) |
8 g NaCL 0.2 g KCL 1.44 g Na2HPO4 0.24 g KH2PO4 1 L water Adjust to a pH of 7.4 and water to 1 L and autoclave |
||
Microfuge tubes | Fisher | 05-408-138 | 2 ml or 1.5 ml tubes |
Shaker | Any shaker that causes the liquid to gently move will work | ||
Diaminopimelic acid | Sigma | D-1377 | If needed, supplement media to a concentration or 1 mM |