における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微鏡の使用<em> Cエレガンス</em>胚
Summary
ここで説明<em生体内で></em回転するディスク共焦点顕微鏡と組み合わせてmicroincubation室を介してガス流を用いた無酸素に暴露された動物の画像サブ細胞構造へ>テクニック。この方法は簡単で、実験パラメータとモデルの様々なシステムに適合するように十分な柔軟性を備えています。
Abstract
Caenorhabditsエレガンスは、成人と胎児の段階の透明度だけでなく、融合タンパク質1-4の無数を表現する遺伝子変異体およびトランスジェニック系統の可用性によって促進されるストレス耐性、の研究に広く用いられている。また、このような細胞分裂のような動的なプロセスは、蛍光標識したレポータータンパク質を使用して表示できます。有糸分裂の研究は、無傷の生物を含む様々なシステムでタイムラプス実験の使用によって容易にすることができ、したがって初期のC.線虫の胚はよくこの研究に適しています。ここで紹介する無酸素に応答して、それによって細胞内構造のin vivoイメージング技術（99.999％N 2、<2 ppmのO 2）があるストレスが高倍率の顕微鏡でのセットアップを使用した単純なガスの流れを使用することで可能です。 microincubation室が通じ窒素ガスの流れと回転するディスク共焦点顕微鏡と組み合わせて使用され動物は、in vivoで画像化することができる管理された環境を作成することができます。 GFPタグガンマチューブリンやヒストン用いて、ダイナミクスと細胞分裂の逮捕は、酸素欠乏環境にさらされている間と後に、前に、監視することができます。この手法の結果は、酸素欠乏にさらされた胚の割球内の高解像度、詳細なビデオや細胞構造のイメージです。
Protocol
Representative Results
Discussion
酸素欠乏と仮死状態
深刻な酸素欠乏への曝露は、いくつかの生物にとって致命的なことができますが、いくつかの生物が無酸素への暴露を生き抜いてきた。 Cの場合にはelegansは 、無酸素暴露の生存率は、発達段階や酸素欠乏に対する応答に依存するエントリが観察可能な生物学的プロセスの数が逮捕された仮死状態に可逆的である。酸素は環境7,9に再…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、入力とパディーヤラボのメンバーからのコメントに感謝の意を伝えたい。この作品で線虫株は研究資源のためのNIHナショナルセンター（NCRR）によって運営されている線虫の遺伝学センターから提供された。我々は、共焦点顕微鏡について技術的な支援のために博士ロンターンブルを認め、感謝しています。この作品は、PAPに国立科学財団（NSF-IOS、キャリア）からの助成金によって支えられてきた
Materials
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
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