استخدام الميكروسكوب الفاصل الزمني لتصور نقص الأكسجين الناجم عن تعطل الحركة في<em> C. ايليجانس</em> الأجنة
Summary
الموصوفة هنا هو<em> في الجسم الحي</em> التقنية لهياكل شبه الخلوية الصورة في حيوانات تعرضت لنقص الأكسجين باستخدام تدفق الغاز من خلال غرفة microincubation جنبا إلى جنب مع القرص الغزل المجهر متحد البؤر. هذا الأسلوب واضح ومباشر ومرنة بما يكفي لتناسب مجموعة متنوعة من المعلمات التجريبية ونظم النموذج.
Abstract
وقد استخدم على نطاق واسع Caenorhabdits ايليجانس في دراسة مقاومة الإجهاد، والتي سهلت من الشفافية في مراحل الجنين والكبار فضلا عن توافر المسوخ الجينية والسلالات المحورة وراثيا معربا عن عدد لا يحصى من البروتينات الانصهار 1-4. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن عرض العمليات الحيوية مثل البروتينات انقسام الخلايا باستخدام مراسل fluorescently المسمى. ويمكن تيسير دراسة الانقسام من خلال استخدام الوقت الفاصل بين التجارب في مختلف النظم بما في ذلك الكائنات سليمة، وبالتالي في وقت مبكر C. هي مناسبة تماما ايليجانس الجنين لهذه الدراسة. المقدمة هنا هي تقنية التصوير التي في الجسم الحي الفرعية الخلوية الهياكل استجابة لنقص الأكسجين (99.999٪ N 2، <جزء في المليون 2 O 2) الإجهاد من الممكن استخدام تدفق الغاز من خلال الإعداد بسيطة على المجهر رفيع المستوى. يتم استخدام غرفة microincubation بالتزامن مع تدفق غاز النيتروجين من خلال المجهر والقرص الغزل مبائرلخلق بيئة تسيطر عليها فيه ولا يمكن تصوير الحيوانات في الجسم الحي. باستخدام GFP الموسومة تويولين جاما وهيستون، يمكن رصد ديناميات واعتقال انقسام الخلايا قبل وأثناء وبعد التعرض للبيئة الأوكسجين المحرومين. نتائج هذه التقنية هي عالية الدقة والفيديو والصور المفصلة للهياكل الخلايا خلال blastomeres الأجنة تتعرض للحرمان الأكسجين.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحرمان الأوكسجين ويعلق إحياء
على الرغم من أن التعرض للحرمان الأكسجين الحاد يمكن أن تكون قاتلة لبعض الكائنات الحية، بعض الكائنات الحية قادرة على البقاء على قيد الحياة التعرض لنقص الأكسجين. في حالة C. ايليجانس، بقاء التعرض نقص…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعرب عن تقديرنا لالمدخلات والتعليقات من أعضاء مختبر باديلا. وقدمت سلالات النيماتودا في هذا العمل من قبل مركز علم الوراثة Caenorhabditis، الذي يتم تمويله من قبل المركز الوطني لبحوث الموارد NIH (NCRR). نعترف ونشكر الدكتور لون تيرنبول للمساعدة التقنية مع المجهري متحد البؤر. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF-IOS، والوظيفي) لPAP
Materials
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
- Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
- Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
- Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
- Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
- Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, P. A., Padilla, . Anoxia. , (2012).
- Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
- Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).
