Brug af Time Lapse Microscopy at Visualiser Anoxia-induceret Suspended Animation i<em> C. elegans</em> Embryoner
Summary
Beskrevet her er en<em> In vivo</em> Teknik til billede subcellulære strukturer i dyr udsat for anoxi ved hjælp af en gasstrøm gennem microincubation kammer i forbindelse med en roterende skive konfokalt mikroskop. Denne metode er enkel og fleksibel nok til at passe til en række af eksperimentelle parametre og modelsystemer.
Abstract
Caenorhabdits elegans er blevet udbredt i studiet af stress modstand, som lettes ved gennemskueligheden af voksne og embryo faser samt af tilgængeligheden af genetiske mutanter og transgene stammer, der udtrykker et utal af fusionsproteiner 1-4. Desuden kan dynamiske processer såsom celledeling ses med fluorescensmærkede reportermolekyler proteiner. Studiet af mitose kan lettes ved brug af time-lapse eksperimenter i forskellige systemer, herunder intakte organismer, og dermed den tidlige C. elegans embryo er velegnet til denne undersøgelse. Præsenteres her er en teknik, som in vivo-afbildning af sub-cellulære strukturer som reaktion på anoxiske (99,999% N2, <2 ppm O2) stress er muligt ved hjælp af en simpel gasstrøm gennem opsætning på en kraftig mikroskop. En microincubation kammer anvendes sammen med nitrogengas strømme gennem og en roterende skive konfokalt mikroskopat skabe et kontrolleret miljø, hvor dyrene kan blive afbildet in vivo. Brug af GFP-mærkede gamma tubulin og histon, kan den dynamik og anholdelse af celledeling monitoreres før, under og efter udsættelse for en ilt-frataget miljø. Resultaterne af denne teknik har en høj opløsning, detaljerede videoer og billeder af cellulære strukturer i blastomeres af embryoner udsat for ilt afsavn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ilt afsavn og suspenderet animation
Skønt udsættelse for svær iltmangel kan være dødelig for visse organismer, nogle organismer er i stand til at overleve eksponering for iltmangel. I tilfælde af C. elegans, overlevelse af anoxi eksponering afhænger udviklingsstadiet og respons på iltmangel er trådt ind i en reversibel tilstand af suspenderet animation i hvilken en række observerbare biologiske processer bliver arresteret. Celledeling, udvikling, bevægelse, spise og reproduk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne udtrykke vores påskønnelse for input og kommentarer fra medlemmer af Padilla Lab. Nematode stammer i dette arbejde blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center, som er finansieret af NIH National Center for Forskning Ressourcer (NCRR). Vi anerkender og takker Dr. Lon Turnbull om teknisk bistand med konfokal mikroskopi. Dette arbejde er blevet støttet af en bevilling fra National Science Foundation (NSF-IOS, karriere) til PAP
Materials
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
- Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
- Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
- Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
- Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
- Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, P. A., Padilla, . Anoxia. , (2012).
- Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
- Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).
