תאר כאן<em> In vivo</em> טכניקה למבני תמונת משנה הסלולר בבעלי חיים שנחשפו לחוסר חמצן באמצעות זרימת גז דרך חדר microincubation בשיתוף עם מיקרוסקופ confocal דיסקה מסתובב. שיטה זו היא פשוטה וגמישה מספיק כדי להתאים למגוון רחב של פרמטרים ניסיוניים ומערכות מודל.
Abstract
elegans Caenorhabdits כבר נעשה שימוש נרחב בחקר עמידות למצבי עקה, שהקלה על ידי השקיפות של השלבים הבוגרים ועובר, כמו גם על ידי הזמינות של מוטציות גנטיות וזנים מהונדסים המבטאים את מספר עצום של חלבוני היתוך 1-4. בנוסף, תהליכים דינמיים כגון חלוקת תא ניתן לצפות באמצעות חלבונים שכותרתו fluorescently כתב. המחקר של מיטוזה ניתן מתאפשר באמצעות השימוש בניסויי זמן לשגות במערכות שונות, כוללים אורגניזמים שלמים, ולכן מוקדם ג עובר elegans גם מתאים למחקר זה. מוצג כאן היא טכניקה שבאמצעותה בתחום הדמית vivo של מבנים תת סלולריים בתגובה לanoxic (99.999% N 2; <2 עמודים לדקת פלט 2) לחץ אפשרי באמצעות זרימת גז פשוט ועד התקנה במיקרוסקופ רב עצמה. קאמרי microincubation משמש יחד עם זרימת חנקן וגז באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובבכדי ליצור סביבה מבוקרת שבה ניתן הדמית בעלי חיים בחי. שימוש GFP מתויג-טובולין גמא והיסטון, הדינמיקה ומעצרו של חלוקת תא ניתן לנטר לפני, במהלך ולאחר החשיפה לסביבת חמצן מקופח-. התוצאות של טכניקה זו הן ברזולוציה גבוה, קטעי וידאו ותמונות מפורטים של מבנים תאיים בתוך לסטומרים של עוברים שנחשפו למחסור בחמצן.
Protocol
1. לדוגמא הכנה לייצר או להשיג המהונדס ג המתאים elegans להתאמץ עניין שימוש במתודולוגיות מהונדסות או מCaenorhabditis גנטיקת מלאי מרכז (CGC) או קולגה. במקרה זה אנו משתמשים במתח TH32 (עוגה-1 :: TBG-1 :: GFP; עוגה-1 :: GFP :: H2B) 5<…
Representative Results
עוברי ג elegans החשופים למחסור בחמצן קשה (אנוקסיה) מסוגלים לשרוד במעצר תהליכים ביולוגיים הכולל פיתוח וחלוקת תא 7. מעצר אנוקסיה המושרית של חלוקת תא יכול להיות במעקב, ברמת משנה הסלולר, באמצעות תא microincubation בשיתוף עם זרימת חנקן וגז באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתו?…
Discussion
מחסור בחמצן ואנימצית מושעה
למרות חשיפה למחסור בחמצן חמור יכולה להיות קטלנית לאורגניזמים מסוימים, כמה אורגניזמים מסוגלים לשרוד חשיפה לחמצן בדם. במקרה של ג elegans, הישרדות חשיפת אנוקסיה תלויה על במה ותגובה לאנוקסיה התפתחותית היא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להביע את הערכתנו לקלט והערות מחברי מעבדת הפדייה. זנים נמטודות בעבודה זו נמסרו על ידי גנטיקת Caenorhabditis המרכז, אשר ממומן על ידי NIH המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR). אנו מכירים בכך ומודים לד"ר לון טרנבול לסיוע טכני במיקרוסקופיה confocal. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומי למדע (NSF-IOS, קריירה) לPAP
Materials
Reagents/Equipment
Composition
Hypochlorite solution
0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20
M9 buffer
3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O
Garcia, A. M., Ladage, M. L., Padilla, P. A. Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos. J. Vis. Exp. (70), e4319, doi:10.3791/4319 (2012).