에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용<em> C. elegans</em> 태아
Summary
는 여기에 설명<em> 생체 내</em회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 microincubation 챔버를 통해 가스의 흐름을 이용하여 산소 결핍에 노출 동물의 이미지를 하위 세포 구조에> 기술. 이 방법은 간단하고 실험 매개 변수 및 모델 시스템의 다양한 맞게 할 수있을만큼 유연하다.
Abstract
Caenorhabdits elegans는 성인과 배아 단계의 투명성에 의해뿐만 아니라 융합 단백질 1-4의 무수한을 표현 유전자 돌연변이 유전자 변형 종자의 가용성에 의해 촉진되어 스트레스 저항의 연구에서 널리 사용되었습니다. 또한, 이러한 세포 분열과 같은 동적 프로세스는 휘황 표시 기자 단백질을 사용하여 볼 수 있습니다. 유사 분열의 연구가 손상 생물 등 다양한 시스템에서 시간 경과 실험의 사용을 통해 촉진 될 수있다; 따라서 초기 C. elegans의 배아가 잘 본 연구에 적합합니다. 고성능 현미경에 설치를 통해 간단한 가스의 흐름을 이용하여 스트레스가 가능합니다, 여기에 제시된 것은 anoxic에 대한 응답 (<2 ppm으로 O 2 99.999 % N 2) 하위 세포 구조를 생체 이미징에있는이 기술입니다. microincubation 챔버는을 통해 질소 가스 흐름과 회전 디스크 공 촛점 현미경과 함께 사용됩니다동물 생체에 이미징 할 수있는 통제 된 환경을 만들 수 있습니다. 사용 GFP를 태그 감마 tubulin과 히스톤은 역학과 세포 분열의 체포는 동안과 산소 박탈 환경에 노출 후, 전에 모니터 할 수 있습니다. 이 기법의 결과는 산소가 결핍되어서에 노출 배아의 blastomeres에서 높은 해상도, 자세한 동영상 및 세포 구조의 이미지입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
산소가 결핍되어서 및 일시 중지 애니메이션
심각한 산소가 결핍되어서에 노출 어떤 생물에 치명적일 수 있지만, 일부 생물은 산소 결핍에 노출 생존 할 수 있습니다. C.의 경우 elegans는 산소 결핍 노출의 생존은 발달 단계 및 산소 결핍에 대한 응답에 따라 달라집니다 항목은 관찰 할 수있는 생물학적 과정의 번호가 체포되는 정지 애니메이션의 치료 상태로 있습?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 입력 및 빠 디야 연구소 회원의 의견을 우리의 감사를 전달하고 싶습니다. 이 작품에서 선충류의 긴장은 연구 자원에 대한 NIH 국립 센터 (NCRR)의 지원을 받고 있습니다 Caenorhabditis 유전학 센터에 의해 제공되었다. 우리는 공 촛점 현미경과 기술 지원을 위해 박사 론 턴벌을 인정하고 감사합니다. 이 작품은 PAP에 대한 국립 과학 재단 (NSF-IOS, 직업)에서 교부금에 의해 지원되었습니다
Materials
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
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