Bruk av Time Lapse Mikroskopi å visualisere anoxia-indusert suspendert animasjon i<em> C. elegans</em> Embryoer
Summary
Beskrevet her er en<em> In vivo</em> Teknikk til bildet sub-cellulære strukturer i dyr eksponert for anoksi hjelp en gasstrøm gjennom microincubation kammer i forbindelse med en roterende plate konfokal mikroskop. Denne metoden er enkel og fleksibel nok til å passe en rekke eksperimentelle parametre og modellere systemer.
Abstract
Caenorhabdits elegans har blitt brukt i stor utstrekning i studiet av stresstoleranse, som lettes av gjennomsiktigheten av de voksne og embryo stadier samt ved tilgjengeligheten av genetiske mutanter og transgene stammer som uttrykker en myriade av fusjonsproteiner 1-4. I tillegg, kan dynamiske prosesser som celledeling vises ved hjelp fluorescensmerkede rapportørgrupper proteiner. Studiet av mitose kan lettes ved bruk av tid-lapse eksperimenter i forskjellige systemer, inkludert intakte organismer, derfor tidlig C. elegans embryo er godt egnet for denne studien. Presenteres her er en teknikk som i vivo avbildning av sub-cellulære strukturer som svar på anoksisk (99,999% N 2; <2 ppm O 2) stress er mulig ved hjelp av en enkel gass strømme gjennom oppsettet på en høy-drevet mikroskop. En microincubation kammer brukes sammen med nitrogengasstrøm gjennom og en roterende plate konfokal mikroskopå skape et kontrollert miljø hvor dyr kan avbildes i vivo. Bruke GFP-merket gamma tubulin og histon kan dynamikken og arrest av celledeling overvåkes før, under og etter eksponering til en oksygen-berøvet miljø. Resultatene av denne teknikken er høyoppløselig, detaljrike videoer og bilder av cellulære strukturer innenfor blastomeres av embryoer utsatt for oksygenmangel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oksygenmangel og suspendert animasjon
Selv om eksponeringen til alvorlig oksygentap kan være dødelig for enkelte organismer, noen organismer er i stand til å overleve eksponering anoksi. I tilfelle av C. elegans, avhenger overlevelse av anoksi eksponering på utviklingsstadiet og respons på anoksi er trådt i en reversibel tilstand av suspendert animasjon der en rekke observerbare biologiske prosesser er arrestert. Celledeling, utvikling, bevegelse, spising og reproduktive prosesse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å formidle vår takknemlighet for innspill og kommentarer fra medlemmer av Padilla Lab. Nematode stammer i dette arbeidet ble gitt av Caenorhabditis Genetics Center, som er finansiert av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Vi erkjenner og takker Dr. Lon Turnbull for teknisk assistanse med konfokalmikroskopi. Dette arbeidet har vært støttet av et stipend fra National Science Foundation (NSF-IOS, KARRIERE) til PAP
Materials
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
- Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
- Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
- Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
- Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
- Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, P. A., Padilla, . Anoxia. , (2012).
- Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
- Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).
