Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme
Summary
Yakın kızılötesi floresans (NIRF) kullanarak en son geliştirilen görüntüleme teknikleri lenfatik sistem kanseri metastazı oynadığı rol, immün yanıt, yara onarımı ve diğer lenfatik ilişkili hastalıkların ortaya çıkmasına yardımcı olabilir.
Abstract
Lenfatik damar sistemi, sıvı dengesinin korur bağırsaktaki immün gözetim ve aracılık yağ emilimini sağlar dolaşım sisteminin önemli bir bileşenidir. Oysa eleştirel fonksiyonuna rağmen, lenfatik sistem sağlığı ve hastalıkları 1 bu işlevlere hizmet adapte nasıl nispeten biraz anlayış vardır. Son zamanlarda, Gen III-, dinamik görüntü lenfatik mimarisi ve lenf gibi iz yakın kızılötesi floresan (NIRF) boya yönetim ve özel kullanarak lenfatik disfonksiyon muzdarip kişilerin yanı sıra normal insan deneklerde "pompalama" işlemi yeteneğini göstermiştir görüntüleme sistemi 2-4 yoğunlaştı. NIRF görüntüleme insan hastalıkları ile lenfatik mimarisi ve işlevi dramatik değişiklikler gösterdi. Bu değişikliklerin ortaya çıkar ve yeni hayvan modelleri kendi genetik ve moleküler temelini gün ışığına geliştirilmektedir nasıl belirsizliğini koruyor. Bu protokol, biz NIRF lenfatik, s sunmakalışveriş hayvan görüntüleme 5,6 green (ICG), insanlarda 7. 50 yıldır kullanılan bir boya ve tercihen fare ve insan albumin 8 bağlayan NIRF boya etiketli siklik albümin bağlanma alanı (cABD-IRDye800) peptid indosiyanin kullanarak . ICG göre yaklaşık 5.5 kat daha parlak, cABD-IRDye800 benzer bir lenfatik açıklık bir profile sahiptir ve görüntüleme 8 için yeterli NIRF sinyal elde etmek için ICG'den daha küçük dozlar halinde enjekte edilebilir. Interstisyel boşluk 8 albümin hem cABD-IRDye800 ve ICG bağlama, her ikisi de içine ve lenfatikler içerisinde aktif bir protein taşıma tasvir edebilir çünkü. İntradermal (ID) ICG enjeksiyonu (5-50 ul) (645 uM) ya da tuzlu su içinde cABD-IRDye800 (200 uM), her bir arka ayak ve / veya tabanının sol ve sağ taraf dorsal ile uygulanırlar Bir izofluran-anestezi fare kuyruğu. Hayvanda çıkan boya konsantrasyonu 83-1,250 ug / kg veya ICG için 113-1,700 mg / kg 'dır içincABD-IRDye800. Hemen enjeksiyonları takiben, fonksiyonel lenfatik görüntüleme özelleştirilmiş, küçük hayvan NIRF görüntüleme sistemi kullanılarak en fazla 1 saat için yapılır. Tüm hayvan uzamsal çözünürlük derinliği 3 cm 9 elde edilebilir yapıların floresan lenfatik 100 mikron veya daha az olan gemiler ve görüntüleri tasvir edebilir. Görüntüleri V + + yazılımı kullanılarak kazanılmış ve ImageJ veya MATLAB yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Analiz sırasında, tüm damar çapı kapsayan faiz (ROI) ardışık bölgeler belirli bir lenf damar boyunca çizilir. Her bir ROI için ölçüler kantitatif lenf damarları yoluyla hareket "paketleri" değerlendirmek için her bir ROI için ölçülür verilen damar ve NIRF yoğunluğu için sabit tutulur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz farelerde etiketli lenf damarlarının görüntüleri yakalamak için özel, küçük hayvan NIRF görüntüleme sistemi kullanın. Lenf dolaşımı filmleri oluşturmak için, 300 veya daha fazla görüntü alınır. Filmlerde lenfatiklerin fonksiyonel analizi için, iki veya daha fazla ROI'ler manuel lenf damarı boyunca çizilir. İB'nin boyutları her bir kap için sabit tutulur ve yaklaşık olarak damar çapı vardır. Bütün hayvanlar uzaysal çözünürlüğü 100 mikron veya daha az olan floresan l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 CA128919 ve NIH R01 HL092923: Bu çalışma Eva Sevick için aşağıdaki bağışları ile desteklenmiştir.
Materials
| Solutions, Reagents, and Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Indocyanine green (ICG) | Patheon Italia S.P.A. | NDC 25431-424-02 | Reconstitute to 645 μM (5 μg/10 μL) |
| Cyclic Albumin Binding Domain(cABD) | Bachem | Custom | Reconstitute to 200 μM (6.8 μg/10 μL) |
| IRDye800 | Li-COR | IRDye 800CW | Reconstitute according to manufacture’s instructions; conjugate with cABD at equilmolar concentrations |
| Sterile Water | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | NDC 0409-4887-10 | |
| NAIR | Church & Dwight Co., Inc. | Local Stores | www.nairlikeneverbefore.com |
| Imaging System (components below) | Center for Molecular Imaging | N/A | Custom-built in our laboratories. |
| Electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera | Princeton Instruments, Trenton, NJ | Photon Max 512 | |
| Nikon camera lens | Nikon Inc., Melville, NY | Model No. 1992, Nikkor 28mm | |
| Optical filter | Andover Corp., Salem,NH | ANDV11333 | Two 830.0/10.0 nm bandpass filters are used in front of lens |
| 785-nm laser diode | Intense Ltd, North Brunswick, NJ | 1005-9MM-78503 | 500 mW of optical output |
| Collimating optics | Thorlabs, Newton, NJ | C240TME-B | Collimates laser output prior to cleanup filter |
| Clean-up filter | Semrock, Inc., Rochester, NY | LD01-785/10-25 | Removes laser emission in fluorescence band |
| Optical diffuser | Thorlabs, Newton, NJ | ED1-C20 | Diffuses the laser over the animal |
| V++ | Digital Optics, Browns Bay, Auckland, New Zealand | Version 5.0 | Software used to control camera system and save images to computer. http://digitaloptics.net/ |
| Analytic Software Either of the following software packages can be used for image analysis | |||
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD | Most current version available | Freeware available at http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| MATLAB | MathWorks, Natick, MA | Version 2008a or later | http://www.mathworks.com/ |
References
- Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
- Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
- Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
- Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
- Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
- Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
- Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
- Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
- Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
- Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
- Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
- Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
- Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
- Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
- Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
- Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
- Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).
