Generation of Human induceret pluripotente stamceller fra perifert blod Brug af STEMCCA lentivirusvektor
Summary
Her viser vi en enkel og effektiv protokol til generering af humane iPSCs 3-4 ml perifert blod under anvendelse af en enkelt lentiviral omprogrammering vektor. Omprogrammering af let tilgængelige blodlegemer lover at fremskynde udnyttelsen af IPSC teknologi ved at gøre det tilgængeligt for et bredere forskningsmiljø.
Abstract
Ved ektopisk ekspression af fire transkriptionsfaktorer, Oct4, Klf4,, Sox2 og cMyc kan humane somatiske celler omdannes til en pluripotent tilstand, genererer såkaldte induceret pluripotente stamceller (iPSCs) 1-4. Patient-specifikke iPSCs mangler de etiske bekymringer, der omgiver embryonale stamceller (ESC) og ville omgå eventuel immunafstødning. Således har iPSCs tiltrukket sig betydelig opmærksomhed for sygdom modelundersøgelser, screening af farmakologiske forbindelser, og regenerative terapier 5.
Vi har vist dannelsen af transgen-free humane iPSCs fra patienter med forskellige lungesygdomme anvendelse af en enkelt udskæres polycistronisk lentiviral Stem Cell Kassette (STEMCCA) koder for Yamanaka faktorer 6. Disse IPSC linjer blev genereret fra hudfibroblaster, den mest almindelige celle type, der anvendes til omprogrammering. Normalt opnåelse af fibroblaster kræver skin punch biopsi efterfulgt af ekspansion af cellens i kultur for et par passager. Vigtigere, har en række grupper rapporteret omprogrammering af humane perifere blodceller i iPSCs 7-9. I én undersøgelse blev en Tet-inducerbar version af STEMCCA vektoren anvendes 9, som kræves for blodlegemer at blive samtidigt inficeret med en grundlæggende aktiv lentivirus koder for revers tetracyclin transaktivator. I modsætning til fibroblaster, kan perifere blodlegemer indsamles via minimalt invasive procedurer, hvilket reducerer ubehag og lidelse for patienten. En enkel og effektiv protokol til omprogrammering blodlegemer ved hjælp af en konstitutiv enkelt punktafgifter vektor kan fremskynde anvendelsen af IPSC teknologi ved at gøre det tilgængeligt for et bredere forskningsmiljø. Endvidere omprogrammering af perifere blodceller giver mulighed for generering af iPSCs fra individer, hvor hudbiopsier bør undgås (dvs.. Aberrant ardannelse), eller på grund af allerede eksisterende sygdomstilstande forebyggelse af,ng adgang til punch biopsier.
Her viser vi en protokol til generering af humane iPSCs fra perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) ved hjælp af en enkelt floxet-udskæres lentiviral vector konstitutivt udtrykker de 4 faktorer. Nyligt opsamlede eller optøet PBMC'er ekspanderes i 9 dage som beskrevet 10,11 i medium indeholdende ascorbinsyre, SCF, IGF-1, IL-3 og EPO før det transduceret med STEMCCA lentivirus. Celler bliver så udpladet på MEF'er og ESC-lignende kolonier kan visualiseres to uger efter infektion. Endelig er udvalgte kloner ekspanderes og testes til ekspression af de pluripotency markører SSEA-4, Tra-1-60 og Tra-1-81. Denne protokol er enkel, robust og meget konsistent, hvilket giver en pålidelig metode til generering af humane iPSCs fra let tilgængelige 4 ml blod.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi heri beskriver anvendelsen af STEMCCA lentivirusvektoren at generere humane iPSCs fra mononukleære celler isoleret fra nogle få ml frisk indsamlet perifert blod. Protokollen kan også anvendes til at omprogrammere frosne PBMC'er (opnået direkte fra buffy coat), en detalje af betydelige praktiske implikationer ved anvendelse af donorceller erhvervet fra en fjern beliggenhed. Før induktion af omprogrammering, skal isolerede PBMC'er undergår en kritisk udvidelse skridt, der gør en sund prolifererende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Disse undersøgelser blev finansieret delvist af NIH UO1HL107443-01 Award til GJM og GM.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with sodium citrate | BD Biosciences | 362760 | |
| QBSF-60 Stem Cell Medium | Quality Biological | 160-204-101 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140 | |
| β-mercaptoethanol | MP Biomedicals | 190242 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544 | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| EPO | R&D Systems | 286-EP | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| Polybrene | Sigma | H-9268 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| ES Cell Marker Sample Kit | Millipore | SCR002 |
References
- Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
- Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
- Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
- vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).
