Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l'activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs
Summary
Une procédure est décrite pour la manipulation de l'activité du cortex cérébral neurones pyramidaux optogenetically tandis que l'électroencéphalogramme, électromyogramme, et la concentration de lactate cérébral sont surveillés. Enregistrements expérimentaux sont effectués sur les câbles attachés-souris tandis qu'ils subissent spontanément veille / sommeil cycles. Optogenetic matériel est assemblé dans notre laboratoire, le matériel d'enregistrement est disponible dans le commerce.
Abstract
Bien que le cerveau représente moins de 5% de la masse du corps, il utilise environ un quart du glucose utilisé par le corps au repos 1. La fonction de non sommeil à mouvements oculaires rapides (NREMS), la plus grande partie du sommeil par le temps, est incertain. Cependant, un trait saillant de NREMS est une réduction significative du taux d'utilisation du glucose cérébral par rapport à l'état de veille 2-4. Ceci et d'autres constatations ont conduit à la croyance largement répandue que le sommeil a une fonction liée au métabolisme cérébral. Cependant, les mécanismes sous-jacents à la réduction du métabolisme du glucose cérébral pendant NREMS restent à élucider.
Un phénomène lié à NREMS qui pourraient avoir une incidence sur le taux métabolique cérébrale est l'apparition d'ondes lentes, des oscillations à des fréquences de moins de 4 Hz, à l'électroencéphalogramme 5,6. Ces ondes lentes détectées au niveau de la boîte crânienne ou cérébrale surface corticale refléter laoscillations de neurones sous-jacents entre un état dépolarisé / et un état hyperpolarisé / bas 7. Pendant l'état bas, les cellules ne subissent pas de potentiels d'action pour des intervalles allant jusqu'à plusieurs millisecondes cents. Restauration des gradients de concentration ionique à la suite de potentiels d'action représente une charge importante du métabolisme de la cellule 8; absence de potentiels d'action pendant les états associés à la baisse de NREMS peuvent contribuer au métabolisme réduit par rapport à réveiller.
Deux défis techniques ont dû être résolues pour que cette relation hypothétique à tester. Tout d'abord, il était nécessaire de mesurer cérébrale métabolisme glycolytique avec une résolution temporelle reflète la dynamique de l'EEG cérébrale (soit plus de quelques secondes plutôt qu'en quelques minutes). Pour ce faire, nous avons mesuré la concentration de lactate, le produit de la glycolyse aérobie, et donc une lecture de la vitesse du métabolisme du glucose dans le cerveau des souris. Lactate étaitmesurée à l'aide d'un capteur à base de lactate oxydase temps réel incorporée dans le cortex frontal. Le mécanisme de détection comprend une électrode de platine-iridium entouré d'une couche de molécules de lactate oxydase. Métabolisme du lactate par la lactate oxydase produisant du peroxyde d'hydrogène, qui produit un courant dans l'électrode de platine-iridium. Si une montée en puissance de la glycolyse cérébrale permet une augmentation de la concentration en substrat pour la lactate oxydase, qui est ensuite réfléchie en courant accrue à l'électrode de détection. Il était en outre nécessaire de mesurer ces variables tout en manipulant l'excitabilité du cortex cérébral, afin d'isoler cette variable à partir d'autres facettes de NREMS.
Nous avons conçu un système expérimental pour la mesure simultanée de l'activité neuronale par l'intermédiaire du elecetroencephalogram, la mesure du flux glycolytique par l'intermédiaire d'un biocapteur lactate, et la manipulation de l'activité neuronale cérébrale corticale via l'activation de la pyramide optogeneticMidal neurones. Nous avons utilisé ce système pour documenter la relation entre le sommeil liés à des formes d'onde électroencéphalographique et la dynamique moment-à-moment de la concentration de lactate dans le cortex cérébral. Le protocole peut être utile pour toute personne qui s'intéresse à l'étude, à se comporter librement les rongeurs, la relation entre l'activité neuronale mesurée au niveau électroencéphalographique et énergétique cellulaire dans le cerveau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes présentées ici permettent de mesurer la relation entre le sommeil et les changements dans la concentration dans le cerveau du lactate glycolytique intermédiaire sur une échelle de temps n'était pas possible auparavant. Animaux subissent des transitions spontanées entre sillage, NREMS et REMS. En outre, nous sommes en mesure d'appliquer des stimuli optogenetic alors que les animaux subissent ces transitions. Les données recueillies à ce jour montrent que l'impact à la fois spontané et …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche financée par le ministère de la Défense (Defense Advanced Research Projects Agency, Faculty Award Young, Grant Nombre N66001-09-1-2117) et NINDS (R15NS070734).
Materials
| Component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BASi Mouse Guide Cannula | Pinnacle Technology/BASi Inc | 7032 | |
| Lactate Biosensor | Pinnacle Technology | 7004 | |
| Head Mount | Pinnacle Technology | 8402 | |
| Sleep/Biosensor Recording system | Pinnacle Technology | 8400-K1-SL | 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor |
| Tethered Mouse in-vitro Calibration kit | Pinnacle Technology | 7000-K1-T | |
| Fiber Optic Guide Cannula | Plastics One | C312G | 21 Gauge Guide Cannula |
| Dummy Cannula | Plastics One | C312DC | 21 Gauge Dummy |
| Diamond Fiber Scribe | Thorlabs | S90W | |
| Fiber Connector Crimp Tool | Thorlabs | CT042 | |
| Furcation Tubing | Thorlabs | FT030 | 03.0 mm |
| Thorlabs | T10S13 | Max Dia. 0.012 | |
| Furcation Tube Stripper | Thorlabs | FTS3 | |
| Bare Hard Cladding Multimode Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm Core, 0.37 NA |
| Wire Snips/Kevlar Shears | Thorlabs | T865 | |
| Fiber Optic Epoxy | Thorlabs | F112 | |
| Fiber Stripper Tool | Thorlabs | ||
| Glass Polishing Plate | Thorlabs | CTG913 | |
| Rubber Polishing Pad | Thorlabs | NRS913 | |
| Eye Loupe | Thorlabs | JEL10 | |
| Kim Wipes | Thorlabs | KW32 | |
| Compressed Air | Thorlabs | CA3 | |
| Polishing Puck | Thorlabs | D50-xx | |
| Fiber Inspection scope | Thorlabs | CL-200 | |
| Polishing Films | Thorlabs | LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P | |
| FC/PC connector end | Thorlabs | 30126G2-240 | 240 μm Bore, SS Ferrule |
| MC Stimulus Unit | Multi-Channel Systems | STG-4002 | |
| MC Stimulus Software | Multi-Channel Systems | MC-Stimulus V 2.1.5 | |
| Blue Laser | CrystaLaser | CL473-050-0 | |
| Laser Power supply | CrystaLaser | CL2005 | |
| Fiber Optic Rotary Joint | Doric Lenses | FRJ-v4 | |
| Table 2. Supplies and equipment. |
References
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