Быстрая и эффективная генерация нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных в Multititre Формат плиты
Summary
Протоколы для нейрональной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs), часто отнимает много времени и потребует значительных навыков культуры клеток. Здесь мы адаптировали небольшая молекула на основе дифференциации процедуры в формат пластин multititre, позволяющий простым, быстрым и эффективным поколения человеческие нейроны в управляемом режиме.
Abstract
Существующие протоколы для генерации нейроны из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), часто утомительной в том, что они многоступенчатой процедуры, связанные с выделением и расширением нейронных клеток-предшественников, до терминальной дифференцировки. По сравнению с этим трудоемким подходы, недавно мы обнаружили, что комбинированное торможение тремя сигнальными путями, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, и FGF / ERK, способствует быстрой индукции нейроэктодермы от hPSCs, с последующим немедленным дифференциации в функциональные нейроны. Здесь мы адаптировали нашу процедуру новый формат пластин multititre, дальнейшего повышения ее воспроизводимости и сделать его совместимым с середины пропускная способность приложений. Она включает в себя четыре дня нейроэктодермы образование в плавающих сфер (эмбриоидных органов), а затем еще четыре дня дифференциацию в нейроны под приверженцем условиях. Большинство клеток, полученных с помощью этого протокола, кажется, биполярное сенсорных нейронов. Кроме того,Процедура очень эффективна, не требует особых навыков эксперта, и основан на простом химически определенной среде с экономичным малых молекул. Благодаря этим особенностям, процедура может служить полезной платформой для дальнейшего функционального расследования, а также для клеточного скрининга приближается требующих человеческих сенсорных нейронов или нейронов любого типа.
Introduction
hPSCs, включая эмбрионов, полученных человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), являются плюрипотентных смысле, что они могут дать повод для разных линий клеток в лабораторных условиях 1-2. Многочисленные дифференцированных типов клеток были получены из ЭСК на сегодняшний день, подтверждая мнение, что эти клетки представляют ценный инструмент для научных исследований и клеточных подходов скрининга, а также перспективны для клеточной терапии.
Нейронные протоколов дифференциации ЭСК, как правило, сложный и трудоемкий, поскольку они часто основаны на первом вызывающие общий нервный судьбы, после чего руководство изоляции нейронных предшественников, и последующей дифференциации терминал в данном нейроне типа интересом 3-6. В некоторых связи, эта сложность не удивительно и неизбежным, учитывая, что такое государство-оф-искусство направлены протоколы дифференциации, как правило, поэтапно имитировать раннее развитие человеческого потенциала, whicч само по себе чрезвычайно сложно. С другой стороны, оно может частично отражать наше отсутствие понимания основных молекулярных процессов, в результате дифференциации протоколов, которые еще далеко не полностью оптимизирована.
Что касается превращения недифференцированных hPSCs в нейроэктодермы, Пера и соавт. Установлено, что подавление BMP / SMAD1/5/8 сигнализации повышает нейронной индукции ЭСК 7. Кроме того, инактивация SMAD2 / 3 сигнализация была показана способствовать формированию нейроэктодермы 8. Соответственно, в сочетании инактивации этих двух путей имеет тенденцию приводить к более эффективному нейронной индукции hPSCs 4,9. Совсем недавно, мы показали, что третий сигнальный путь, FGF / ERK, служит сильным репрессор из первых шагов обязательства нейроэктодермальных в ЭСК. С другой стороны, одновременное подавление всех этих трех путей приводит к почти однородным преобразованием ЭСК в нейроэктодермы свсего за четыре дня 10. Впоследствии, высокоэффективных терминальной дифференцировке в функциональные нейроны наблюдалось в течение восьми дней. Нейроны были получены, вероятно, будет сенсорных нейронах периферической нервной системы, которое может частично объяснить их быстрого вывода 10. Дефекты в сенсорных нейронов обслуживания считается причиной некоторых болезней человека, таких как семейные Dysautonomia 11. Для моделирования таких заболеваний, основанный на технологии hiPSC 12, для дальнейшего функциональные характеристики, а также для прикладных целей, не требующих особого типа нейронов, эта дифференциация процедуры могут представлять собой полезную основу.
Тем не менее, стратегия дифференциации мы изначально занято участвуют формирования эмбриональных органов (ЭТ) от скопления колоний ЭСК 10, и это привело к довольно степень неоднородности в отношении EB размеров, а также появилась на компромисс нейрона эффективности формирования в некоторых сеLL линий. Кроме того, из-за неоднородности в размерах EB, способность к систематическому проверить эффекты дополнительных факторов роста или малых молекул, во время и после формирования нейронов, казалось, несколько сбит с толку.
В этом докладе мы адаптировали нашу предыдущую процедуру для средней пропускной совместимы, вынуждены агрегации на основе техники для создания ЭТ в высшей степени размер контролируемой форме, а также показаны в других контекстах 13. Впоследствии ЭТ генерируется в V-формы лунки 96-луночных были переданы в П-образной ультра-низким вложений 96-луночные планшеты, инициировать нейроэктодермы образование в суспензии. Четыре дня спустя, ЭТ может быть высевают что приводит к терминально дифференцированные нейроны с высокой эффективностью и однородностью. Кроме того, день-4 ЭТ были распадается на отдельные клетки и высевают, как такие, в результате которых низкой плотности монослоя человеческих нейронов. Когерентные результаты были получены до сих пор с двумя независимыми де-rived линий ЭСК, HuES6 и NCl3.
В качестве предпосылки, успешное формирование EB было строго зависит от использования синтетических полимеров, поливинилового спирта (ПВС), вместе с рок-ингибитор Y-27632 известно, способствуют выживанию чЭСК 13-14. В результате, однородность ЭТ формируется в 96-V-пластины были существенно расширены по сравнению с формирования ЭТ как массовое культур на основе случайных методов расщепления. Эта система обеспечивает, таким образом значительно улучшить платформу для нейроэктодермы образование в суспензионной культуре, а затем строго контролируемых нейронов при формировании приверженцем условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Большинство дифференциация протоколы с участием EB образования из hPSCs, в том числе наших ранее опубликованных процедуры 10, основаны на ручном или фермента при содействии уборки ЭСК в виде агрегатов, что неизбежно приводит к неоднородности в EB размеров. Этот факт приводит к изменчи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Общества Макса Планка.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
