Generazione rapida e efficiente di neuroni da cellule staminali umane pluripotenti in un formato piatto Multititre
Summary
Protocolli per la differenziazione neuronale di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono spesso molto tempo e richiedono notevoli capacità di colture cellulari. Qui, abbiamo adattato una piccola molecola procedura basata differenziazione di un formato di piastra multititre, permettendo la generazione semplice, rapido, efficace e di neuroni umani in modo controllato.
Abstract
Protocolli esistenti per la generazione di neuroni da cellule staminali pluripotenti (hPSCs) sono spesso noioso in quanto sono procedure multistep coinvolgono l'isolamento e l'espansione di cellule precursori neurali, prima differenziazione terminale. In confronto a questi approcci in termini di tempo, abbiamo recentemente scoperto che l'inibizione combinata di tre vie di segnalazione, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 e FGF / ERK, promuove la rapida induzione neuroectoderma da hPSCs, seguita da immediata differenziazione in neuroni funzionali. Qui, abbiamo adattato la nostra procedura per un nuovo formato di piastra multititre, per migliorare ulteriormente la sua riproducibilità e di renderlo compatibile con metà del throughput delle applicazioni. Esso si articola in quattro giorni di formazione neuroectoderma in sfere galleggianti (corpi embrionali), seguito da altri quattro giorni di differenziamento in neuroni in condizioni aderenti. La maggior parte delle cellule ottenute con questo protocollo sembrano essere i neuroni sensoriali bipolari. Inoltre,la procedura è altamente efficiente, non richiede particolari competenze esperte, e si basa su un mezzo chimicamente definito semplice con piccole molecole costo-efficienti. A causa di queste caratteristiche, la procedura può servire come piattaforma utile per un'ulteriore indagine funzionale così come per la cella di screening avvicina richiedendo umani neuroni sensoriali o neuroni di qualsiasi tipo.
Introduction
hPSCs, composto da embrioni derivati da cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), sono pluripotenti significato che possono dare origine a diverse linee cellulari in vitro 1-2. Numerosi tipi di cellule differenziate sono stati derivati da hESC ad oggi, sostenendo l'idea che queste cellule presentano strumenti utili per la ricerca scientifica e basati su celle approcci di screening, e promettenti per terapie a base di cellule.
Protocolli per la differenziazione neuronale hESC sono solitamente complesse e lunghe quanto sono spesso basati sulla prima sorte indurre complessiva neurale, seguito da isolamento manuale dei progenitori neurali, e la differenziazione terminale successiva in un determinato tipo di neurone di interesse 3-6. In alcuni riguardo, questa complessità non è sorprendente e inevitabile dato che un tale state-of-the-art protocolli di differenziazione diretti tendono a imitare graduale primi stadi dello sviluppo umano, which è di per sé estremamente complesso. D'altra parte, può in parte anche riflettere la nostra mancanza di comprensione dei processi molecolari sottostanti, con conseguente protocolli di differenziazione che sono ancora lungi dall'essere completamente ottimizzato.
Per quanto riguarda la conversione di hPSCs indifferenziate in neuroectoderma, Pera et al. trovato che la soppressione di BMP / SMAD1/5/8 segnalazione aumenta l'induzione neurale del hESC 7. Inoltre, l'inattivazione di SMAD2 / 3 segnalazione ha dimostrato di promuovere la formazione neuroectoderma 8. Di conseguenza, l'inattivazione combinata di queste due vie tende a generare una più efficace di induzione neurale del hPSCs 4,9. Più di recente, abbiamo dimostrato che un percorso di segnalazione terzo, FGF / ERK, funge da repressore forte delle prime fasi di impegno neuroectodermica in hESC. Al contrario, la repressione simultanea di tutti e tre questi percorsi portare a quasi omogenea conversione di hESC in neuroectoderma conin soli quattro giorni 10. Successivamente, la differenziazione terminale altamente efficiente in neuroni funzionali è stato osservato entro otto giorni. I neuroni ottenuti sono stati probabilmente i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico, che può in parte spiegare la loro derivazione rapida 10. Difetti nella manutenzione neurone sensoriale è considerata una causa di alcune patologie umane come disautonomia familiare 11. Per la modellazione di tali malattie basato su tecnologia hiPSC 12, per un'ulteriore caratterizzazione funzionale, nonché per scopi applicati non richiedono alcun tipo particolare di neuroni, questa procedura differenziazione può presentare una base utile.
Tuttavia, la strategia di differenziazione che avevamo originariamente impiegato coinvolto formazione di corpi embrionali (EB) da ciuffi di colonie hESC 10, e ciò ha determinato un bel grado di eterogeneità per quanto riguarda formati EB, e apparso anche di compromettere l'efficienza formazione dei neuroni in alcune ceLinee ll. Inoltre, a causa della eterogeneità in dimensioni EB, la possibilità di verificare sistematicamente effetti dei fattori di crescita addizionali o piccole molecole durante e dopo la formazione dei neuroni sembravano essere alquanto confuso.
In questo rapporto, abbiamo adattato la nostra procedura precedente per un rendimento medio-compatibile, l'aggregazione forzata a base di tecnica per generare EBs in una dimensione altamente controllato modo, come mostrato anche in altri contesti 13. Successivamente, l'EBS generato in forma di V pozzetti di piastre da 96 pozzetti sono state trasferite a forma di U bassissimo attaccamento piastre da 96 pozzetti, per avviare la formazione neuroectoderma in sospensione. Quattro giorni più tardi, l'EBS potrebbe essere piastrate dando origine a neuroni terminalmente differenziate ad alta efficienza e omogeneità. In alternativa, giorno-4 EBs erano dissociate in singole cellule e placcato in quanto tale, che ha portato a bassa densità monostrati di neuroni umani. Risultati coerenti sono stati finora ottenuti con due indipendentemente delinee di hESC rived, HuES6 e NCl3.
Come prerequisito, formazione EB successo era strettamente dipendente l'uso di un polimero sintetico, alcool polivinilico (PVA), insieme con inibitore ROCK Y-27.632 noto per promuovere la sopravvivenza hESC 13-14. Come risultato, l'omogeneità del EBs formata in 96-V-piastre è stata notevolmente migliorata rispetto a formazione di EBS come culture di massa basato su metodi di frazionamento casuali. Questo sistema fornisce quindi una piattaforma significativamente migliorato per la formazione neuroectoderma in coltura in sospensione, seguito dalla formazione neurone altamente controllato in condizioni aderenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Maggior parte dei protocolli di differenziazione che comportano la formazione di EB da hPSCs, compresa la nostra procedura precedentemente pubblicato con il 10, sono basati su manuale o enzima-assistita raccolta di hESC come aggregati, il che porta inevitabilmente a eterogeneità nei formati EB. Questo fatto porta a variabilità in efficienza differenziazione con alcune linee cellulari, rendendo così difficile analisi sistema, in particolare su scala velocità media. Inoltre, la dissezione manuale è alta in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla Max Planck Society.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. |
References
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