Drosophila 망막은 틀에 박힌 방식으로 생성 된 세포 유형의 소수로 구성된 크리스탈과 같은 격자입니다 1. 정교한 유전자 분석에의 복종 할 의무는 복잡한 개발 프로그램의 연구를 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 photoreceptor 차별화를 중심으로 세 이산 발달 단계에서 dissections와 망막의 immunohistochemistry에 대해 설명합니다.
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방법 논문
애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Drosophila melanogaster의 화합물 눈은 약 750 ommatidia (단위 눈)으로 구성되어 있습니다. 각 ommatidium는 렌즈 분비 콘 세포, 안료 세포, 억센 털 셀 및 8 photoreceptors (푸에르토 리코 놈들) R1-R8이 포함 약 20 세포로 구성되어 있습니다. 푸에르토 리코 놈들은 빛에 민감한 안료, Rhodopsins을 (RHS)를 포함 전문 microvillar 구조, rhabdomeres을 수 있습니다. 여섯 푸에르토 리코 놈들의 rhabdomeres (R1-R6)는 사다리꼴을 형성하고 Rh1 3 4이 포함되어 있습니다. R7 및 R8의 rhabdomeres는 사다리꼴의 중심에 직렬로 위치와 빛의 동일한 경로를 공유 할 수 있습니다. R7 및 R8 푸에르토 리코 놈들은 stochastically 두 가지 하위 유형 5 RHS의 다른 조합을 표현 : 'P'하위 유형에서, P R7s의 Rh3는 P R8s에 Rh5와 결합되어, 'Y'하위 유형에 Y R7s의 Rh4이 연관된 반면, Y의 Rh6는 6 7 8 R8s.
푸에르토 리코 놈들과 ommatidia 개발의 초기 사양은 애벌레의 눈 antennal imaginal 디스크, 상피 세포의 monolayer에서 시작됩니다. 차별화의 파도가 디스크 9에서 쓸어과 ommatidia 10-11로 undifferentiated 세포의 조립을 시작합니다. '설립자 셀'R8 먼저 지정하고 R7 12-14 R1-6 그리고 모집합니다.합니다 그 후, pupal 개발하는 동안, 홍보 차별화 rhabdomere 형성, synaptogenesis 결국 RH 표현을 포함한 다양한 형태학의 변화 15로 연결됩니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 망막 형성과 발달 경로에 관한 질문의 다양한 해결하기 위해 적용 할 수있는 망막 개발의 세 정의 된 기간에서 망막 dissections 및 immunohistochemistry하는 방법을 설명합니다. 여기, 우리는 전체 마운트 애벌레의, midpupal 및 성인 망막 (의 단일 셀 레벨에서 stepwise PR 차별화를 시각적으로 이러한 방법을 사용
프로토콜
1. 소개
세 번째 instar 애벌레의, midpupal과 성인 무대 :이 동영상에서는, 우리는 세 가지 정의 개발 기간의 망막 dissections 및 immunohistochemistry하는 방법을 설명합니다. 우리 프로토콜 다른 pupal 단계 (초기 단계에 대한 자세한 내용은, 16 참조)를 위해 일이지만 하나의 초점 평면과 핵의 모든 푸에르토 리코 놈들이의 시각화을 용이하게하는, 쉽게 식별 할 수있는 이미지에 적합하므로, 우리는 midpupal 단계를 선택 전사 인자의 발현 패턴. 후반 pupal 망막의 해부는 성인 망막의 해부와 매우 유사합니다.
첫째, 우리는 원하는 단계에서 유충과 pupae를 수집하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음, 우리는 애벌레의 17-18, midpupal 및 성인 망막의 최적 dissections를 얻는 방법에 대해 설명합니다. 둘째, 우리는 immunohistochemistry와 공 촛점 현미경을 사용하여 이러한 단계에서 PR 개발을 시각화하는 방법을 보여줍니다.
2. 스테이징과 표본의 작성
곤충의 발달 기간은 ....
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토론
1. 문제 해결
우리의 경험에서 dissections가 연습 (최대 몇 주까지)이 필요하고 테이블에 팔꿈치와 팔을 쉴 의해 손가락 분해 요리와 접촉을 갖춘 편안한 손의 위치 21 달성에 의해 촉진된다. 이렇게 만 엄지 손가락, 색인 및 중간 손가락이 미묘한 움직임을 수행합니다.
photoreceptors를 손상시키지 않고 얇은 판을 제거하면 아마도 가장 어려운 단계입니다. 얇은 판의 적목 현상 착색에 대해보고하기가 훨씬 쉽습니다으로 붉은 눈 wildtype과 연습은 흰 눈 돌연변이을 해부하기 전에 이동합니다. 또한, 최적의 대비를 달성 할 수 있도록 분해 요리 아래 뒤와 어두운 배경에서 조명을 사용합니다.
그러나, 적목 색소 형광이며, 이미징 과정에서 높은 배경을 일으킬 수 있습니다. 이 보조 항체의 신호를 약하게 할 수 있습니다. 좋은 전략은 KE하는 것입니.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 HY에 Ehrman의 교제에 의해 지원되었다. H., DV, JR에 뉴욕 대학교 학장의 학위 논문 CD에 DJ로 휄로 십, NIH GrantR01 EY13010 및 DFG 교제에 RJJ, NIH 그랜트 F32EY016309에 의학 연구 박사 친목을위한 제인 코핀 일즈 기념 기금 (RI 2208/1- 1). 우리는 원고에 대한 의견 니나 Vogt와 파멜라 Boodram 감사드립니다.
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재료
| 시약 | |||
| (PBS1x, 산도 7.4) 생리 인산염 버퍼 | 시그마 | 10X 재고 솔루션 (20)를 준비합니다. 실온에서 1X PBS와 상점을 얻기 위해 증류수로 희석. dissections 전에 얼음에 냉각. | |
| 트리톤 - X 100 | 시그마 | 9002-93-1 | 주의 :! 자극 장갑을 착용한다. 와 0.3 % 트리톤 X-100 (PBST). 50 ML의 1xPBS 준비 실온에서 보관하십시오. |
| 37%의 포름 알데히드 용액 | 피셔 과학 | F75P1GAL | 주의 :! 독성, 가능성이 인간의 발암 물질이 장갑을 착용한다. 고정 단계 전에, 신선한 얼음에 PBS로 diluting하여 화학 퓸 배출 후드에 매장을 3.7 % 용액을 준비. |
| 5% 정상적인 말 혈청 | 잭슨 Immuno 연구 | 008-000-001 | PBST 5 % V / V 희석을 준비합니다. 네도에서 보관하십시오. |
| 기본 및 보조 항체 (예 : 돈키 안티 - 양, 알렉사 형석 488, 동키 - 반 토끼, 알렉사 형석 555, 돈키 안티 - 마우스 알렉사 형석 647) | Invitrogen 분자 프로브 | A11015 A31572 A31571 | 네도에서 PBST과 매장에서 1:800 보조 항체를 희석. |
| 알렉사 형석 488 Phalloidin | A12379 | 차 항체 용액에 1:100을 희석. | |
| Slowfade 골드 Antifade 시약 | Invitrogen 분자 프로브 | S36936 | 매체를 장착. -20도에서 보관하십시오. |
| Glycerol | 피셔 과학 | G31-1 | 장착하십시오. 온도는 실온에서 증류수, 상점과 50 %의 희석의 10 ML를 준비합니다. |
| CO 2 | 파리 성충을 anesthetizing하십시오. | ||
| 장비 | |||
| 두 날카로운 집게 (뒤몽 # 55) | 정밀 과학 도구 | 11255-20 | |
| Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 | 다우 코닝 | Sylgard 혼합으로 플라스틱 페트리 접시를 작성하여 Sylgard의 분해 요리를 준비합니다. | |
| 세 잘 유리 분해 요리 | 피셔 과학 | 21-379 | |
| TWO minutien 해부 핀 (0.1 mm 직경)와 두 개의 pinholders (12 ㎝) | 정밀 과학 도구 | 26002-10 | 두 pinholders의 각 한 minutien 핀을 삽입하고 후크를 형성하기 위해 핀 중 하나를 구부린다. |
| 현미경 커버 용지 (22x22-1과 24x40-1) | 피셔 과학 | 12 542A | |
| 현미경 슬라이드 (25x75x1.0 mm, precleaned) | 피셔 과학 | 12-550-143 | |
| 1.5 ML의 microcentrifuge 관 | |||
| 폴란드어 또는 스카치 테이프를 손톱 삭제 | |||
| 궤도 셰이커 | Bellco | ||
| 슬라이드 홀더 상자 | 피셔 과학 | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| 얇은 붓 | |||
| P20와 P200 micropipettes 및 팁 | |||
| 현미경을 해부 | |||
| 얼음과 작은 양동이 | 유리 잘 판, 해부하는 망막과 솔루션을 냉각하십시오. |
참고문헌
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).
- O'Tousa, J. E.
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재인쇄 및 허가
