נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em> דרוזופילה</em> רשתיות

Summary

<em> דרוזופילה</em> רשתית היא סריג הגבישי דמוי המורכבים ממספר קטן של סוגי תאים שנוצרים באופן סטריאוטיפי¹. amenability לניתוח גנטי מתוחכם מאפשר הלימוד של תוכניות התפתחותיות מורכבות. פרוטוקול זה מתאר ניתוחים ואימונוהיסטוכימיה של רשתית בשלושה שלבי התפתחות נפרדים, עם דגש על בידול photoreceptor.

Abstract

העין המורכבת של דרוזופילה melanogaster מורכב מכ 750 אומטידיה (עיני יחידה). כל אומטידיום מורכב מכ 20 תאים, כולל תאי מפרישי עדשה חרוט, תאי פיגמנט, תאי זיפים ושמונה photoreceptors (PRS) R1-R8 ^2. הפורטוריקנים יש מבנים מיוחדים, microvillar את rhabdomeres, המכילים פיגמנטים רגישים לאור, את Rhodopsins (RHS). את rhabdomeres של שישה הפורטוריקנים (R1-R6) בצורת טרפז ומכיל Rh1 ^{3 4.} את rhabdomeres של R7 ו R8 מוצב במקביל במרכז הטרפז ולשתף אותו הנתיב של אור. R7 והפורטוריקנים R8 stochastically להביע שילובים שונים של RHS בשני תתי סוגים עיקריים ^5: בתת סוג 'P', בעמ 'Rh3 R7s היא בשילוב עם Rh5 בעמ R8s, ואילו בתת הסוג "Y", בRh4 y R7s קשור RH6 בy R8s ^{6 7 8.}

מפרט מוקדם של הפורטוריקנים ופיתוח של אומטידיה מתחיל בדיסק זחל עיני מחושים הדמיוני monolayer של תאי האפיתל. גל של בידול חולף על פני הדיסק ⁹ ויוזם את ההרכבה של תאים לא עברו התמיינות לאומטידיה ^10-11. 'תא המייסד' R8 מצוין ראשון ומגייס R1-6 ולאחר מכן R7 ^12-14. לאחר מכן, במהלך התפתחות גלמים, בידול יחסי הציבור מוביל לשינויים נרחבים מורפולוגיים ^15, כולל היווצרות rhabdomere, synaptogenesis וסופו של דבר ביטוי RH.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות לניתוחים ואימונוהיסטוכימיה רשתית בשלוש תקופות מוגדרות של התפתחות רשתית, אשר יכול להיות מיושמות על מנת לטפל במגוון רחב של שאלות הנוגעות להיווצרות רשתית ומסלולי התפתחות. כאן, אנו משתמשים בשיטות אלה כדי להמחיש את בידול יחסי הציבור ההדרגתי ברמת התא בודד בכל הר זחל, midpupal ומבוגרות רשתיות ( <sטרונג> איור 1).

Protocol

1. מבוא בסרטון הזה, אנו מתארים שיטות לניתוחים ואימונוהיסטוכימיה רשתית בשלוש תקופות התפתחותיות מוגדרות: 3 instar הזחל, midpupal ושלב המבוגר. למרות שהפרוטוקול שלנו פועל גם עבור שלבי גלמים אחרים (לפרטים על שלבים מוקדמים יותר, ראה 16), …

Discussion

1. פתרון בעיות

מניסיוננו, נתיחות דורשות תרגול (עד מספר שבועות) והם הקלו על ידי השגת עמדת יד נוחה של ²¹ על נח את המרפקים ואמות על השולחן ובאצבעות יצירת קשר עם צלחת הניתוח. אצבעות בדרך זו, רק אגודלים, אינדקס ובינוניים לבצע תנועות עד…

Materials

			Reagent
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4)	Sigma		Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections.
Triton-X 100	Sigma	9002-93-1	Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature.
37% formaldehyde solution	Fisher Scientific	F75P1GAL	Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice.
5% normal horse serum	Jackson Immuno Research	008-000-001	Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees.
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647)	Invitrogen Molecular Probes	A11015 A31572 A31571	Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees.
Alexa Fluor 488 Phalloidin		A12379	Dilute 1:100 in secondary antibody solution.
Slowfade Gold Antifade reagent	Invitrogen Molecular Probes	S36936	Mounting medium. Store at -20 degrees.
Glycerol	Fisher Scientific	G31-1	For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp.
CO2			For anesthetizing adult flies.
			Equipment
Two sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture.
Three-well glass dissection dishes	Fisher Scientific	21-379
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm)	Fine Science tools	26002-10	Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook.
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1)	Fisher Scientific	12-542A
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned)	Fisher Scientific	12-550-143
1.5 ml microcentrifuge tubes
Clear nail polish or Scotch tape
Orbital shaker	Bellco
Slide holder box	Fisher Scientific
Parafilm	Bemis	PM996
Thin paintbrush
P20 and P200 micropipettes and tips
Dissecting microscope
Small bucket with ice			For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions.