<em> ड्रोसोफिला</em> रेटिना एक क्रिस्टल की तरह सेल प्रकार की एक छोटी संख्या है कि एक टकसाली तरीके में उत्पन्न कर रहे हैं से बना जाली है<sup> 1</sup>. इसके परिष्कृत आनुवांशिक विश्लेषण ज़िम्मा जटिल विकास कार्यक्रमों के अध्ययन की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल फोटोरिसेप्टर भेदभाव पर ध्यान देने के साथ तीन असतत विकास के चरणों में dissections और retinas की immunohistochemistry, का वर्णन करता है.
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की यौगिक आँख के बारे में 750 ommatidia (इकाई आँखों) के होते हैं. प्रत्येक ommatidium लेंस स्रावित शंकु कोशिकाओं, वर्णक कोशिकाओं, एक बाल खड़े सेल और आठ (पीआरएस) photoreceptors R1-R8 2 सहित के बारे में 20 कोशिकाओं से बना है. पीआरएस विशेष microvillar संरचनाओं, rhabdomeres, जो प्रकाश के प्रति संवेदनशील pigments, rhodopsins (RHS) शामिल है. छह पीआरएस rhabdomeres (R1-R6) एक trapezoid फार्म और 3 RH1 4 होते हैं. R7 और R8 की rhabdomeres अग्रानुक्रम में trapezoid के केंद्र में तैनात हैं और प्रकाश की एक ही पथ का हिस्सा है. R7 और R8 पीआरएस stochastically दो मुख्य 5 उपप्रकारों में RHS के विभिन्न संयोजनों व्यक्त: 'पी' के उप में, Rh3 पी R7s में पी R8s में Rh5 साथ युग्मित है, जबकि 'y उप में, y R7s में Rh4 साथ जुड़ा हुआ है Rh6 y में 8 7 6 R8s.
पीआरएस और ommatidia के विकास के प्रारंभिक विनिर्देश लार्वा आंख antennal imaginal डिस्क, उपकला कोशिकाओं के एक monolayer में शुरू होता है. भेदभाव की एक लहर 9 डिस्क भर sweeps और 10-11 ommatidia undifferentiated कोशिकाओं की विधानसभा में शुरू की है. R8 'संस्थापक सेल' 1 निर्दिष्ट किया जाता है और R1-6 और फिर 12-14 R7 रंगरूटों. इसके बाद, पोटा संबंधी विकास के दौरान, पीआर भेदभाव व्यापक morphological 15 rhabdomere गठन, synaptogenesis और अंततः rh अभिव्यक्ति सहित परिवर्तन, की ओर जाता है.
इस प्रोटोकॉल में, हम रेटिना रेटिना विकास के तीन से परिभाषित अवधि, जो रेटिना गठन और विकास के रास्ते से संबंधित सवालों की एक किस्म का पता करने के लिए लागू किया जा सकता है और dissections immunohistochemistry के लिए विधियों का वर्णन. यहाँ, हम इन तरीकों का उपयोग करने के लिए पूरे माउंट लार्वा, midpupal और वयस्क retinas में एकल कोशिका के स्तर पर stepwise पीआर भेदभाव कल्पना ( <sTrong> चित्रा 1).
1. समस्या निवारण
हमारे अनुभव में, dissections अभ्यास (कई हफ्तों के लिए) की आवश्यकता होती है और मेज पर कोहनी और forearms आराम से और उंगलियों विच्छेदन पकवान के साथ संपर्क बनाने के साथ एक आरामदायक हाथ 21 स्था?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम एक Ehrman हरियाणा के लिए फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया. एच., एक जेन ताबूत चिकित्सा अनुसंधान postdoctoral फैलोशिप के लिए बच्चों मेमोरियल RJJ, NIH अनुदान F32EY016309 फंड DV, एक न्यूयॉर्क विश्वविद्यालय के डीन निबंध डीजे फैलोशिप, GrantR01 NIH EY13010 सीडी और जूनियर फैलोशिप DFG (2208/1- आरआई ) 1. हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए नीना Vogt और पामेला Boodram धन्यवाद.
Reagent | |||
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
Equipment | |||
Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
Clear nail polish or Scotch tape | |||
Orbital shaker | Bellco | ||
Slide holder box | Fisher Scientific | ||
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Thin paintbrush | |||
P20 and P200 micropipettes and tips | |||
Dissecting microscope | |||
Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |