Disseksjon og Immunhistokjemi av larver, pupal og Voksen<em> Drosophila</em> Netthinne

Summary

Den<em> Drosophila</em> Netthinnen er en krystall-lignende gitter sammensatt av et lite antall av celletyper som er generert i en stereotyp måte¹. Sin amenability til sofistikert genetisk analyse gjør studiet av komplekse utviklingsprogrammene. Denne protokollen beskriver disseksjoner og immunhistokjemi av netthinne på tre diskrete utviklingsstadier, med fokus på fotoreseptoren differensiering.

Abstract

Den sammensatte øye Drosophila melanogaster består av ca 750 ommatidia (enhet øyne). Hver ommatidium består av ca 20 celler, inkludert objektiv-sekresjon membran celler, pigment celler, en bust celle og åtte fotoreseptorene (PRS) R1-R8 ^to. PRS har spesialisert microvillar strukturer, de rhabdomeres, som inneholder lysfølsomme pigmenter, de Rhodopsins (RHS). De rhabdomeres av seks PRS (R1-R6) danner et trapes og inneholder RH1 ^{3 4.} De rhabdomeres av R7 og R8 er plassert i tandem i sentrum av trapezoid og dele den samme banen av lys. R7 og R8 PRs stokastisk uttrykker ulike kombinasjoner av RHS i to undergrupper ^5: I "p" undertype, er RH3 i p R7s kombinert med RH5 i p R8s, mens i "y" undertype, er RH4 i y R7s forbundet med RH6 i y R8s ^{6 7 8.}

Tidlig spesifikasjon av PRs og utvikling av ommatidia begynner i larve øye-antennal imaginal plate, en monolayer av epitelceller. En bølge av differensiering feier over disk ⁹ og initierer montering av udifferensierte celler til ommatidia ^10-11. The 'grunnlegger celle' R8 er spesifisert først og rekrutterer R1-6 og deretter R7 ^12-14. Deretter, i løpet pupal utvikling, fører PR differensiering til omfattende morfologiske endringer ^15, inkludert rhabdomere formasjon, synaptogenesis og til slutt rh uttrykk.

I denne protokollen beskriver vi metoder for netthinnens disseksjoner og immunhistokjemi på tre definerte perioder med netthinnen utvikling, som kan brukes til å løse en rekke spørsmål om retinal formasjon og utviklingsmessige veier. Her bruker vi disse metodene for å visualisere en trinnvis PR differensiering på enkelt-celle-nivå i hele mount larve, midpupal og voksen netthinne ( <sTrong> Figur 1).

Protocol

1. Innledning I denne videoen beskriver vi metoder for netthinnens disseksjoner og immunhistokjemi på tre definerte utviklingsmål perioder: den tredje instar larver, den midpupal og det voksne stadiet. Selv om vår protokoll fungerer også for andre pupal stadier (for detaljer om tidligere stadier, se 16), valgte vi midpupal scenen, som det er optimalt for bildebehandling alle PRs i ett fokusplan og deres kjerner er lett identifiserbar, noe som letter visualisering av transkripsjo…

Discussion

1. Feilsøking

I vår erfaring, disseksjoner krever praksis (opptil flere uker) og er tilrettelagt av å oppnå en komfortabel håndstilling ²¹ ved hvile albuene og underarmene på bordet, og med fingrene å ta kontakt med disseksjon parabolen. På den måten, bare tommelen, indeksen og midtre fingrene utføre subtile bevegelser.

Fjerne lamina uten å skade fotoreseptorene er trolig den mest utfordrende trinnet. Praksis med rød-eyed wildtype flyr først …

Materials

			Reagent
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4)	Sigma		Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections.
Triton-X 100	Sigma	9002-93-1	Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature.
37% formaldehyde solution	Fisher Scientific	F75P1GAL	Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice.
5% normal horse serum	Jackson Immuno Research	008-000-001	Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees.
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647)	Invitrogen Molecular Probes	A11015 A31572 A31571	Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees.
Alexa Fluor 488 Phalloidin		A12379	Dilute 1:100 in secondary antibody solution.
Slowfade Gold Antifade reagent	Invitrogen Molecular Probes	S36936	Mounting medium. Store at -20 degrees.
Glycerol	Fisher Scientific	G31-1	For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp.
CO2			For anesthetizing adult flies.
			Equipment
Two sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture.
Three-well glass dissection dishes	Fisher Scientific	21-379
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm)	Fine Science tools	26002-10	Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook.
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1)	Fisher Scientific	12-542A
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned)	Fisher Scientific	12-550-143
1.5 ml microcentrifuge tubes
Clear nail polish or Scotch tape
Orbital shaker	Bellco
Slide holder box	Fisher Scientific
Parafilm	Bemis	PM996
Thin paintbrush
P20 and P200 micropipettes and tips
Dissecting microscope
Small bucket with ice			For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions.