Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em> Drosophila</em> Retinas

Summary

O<em> Drosophila</emRetina> é uma estrutura cristalina do tipo composto por um pequeno número de tipos de células que são geradas de um modo estereotipado¹. Sua receptividade à análise genética sofisticada permite o estudo de complexos programas de desenvolvimento. Este protocolo descreve dissecações e imunohistoquímica de retinas em três distintas fases de desenvolvimento, com foco na diferenciação de fotorreceptores.

Abstract

O olho composto de Drosophila melanogaster é composto por cerca de 750 omatídeos (olhos de unidades). Cada omatídeo é composto de cerca de 20 células, incluindo as células secretoras de lente de cone, as células de pigmento, uma célula de cerdas e oito fotorreceptores (RP) R1-R8 ^2. A RP têm estruturas especializadas microvilares, os rhabdomeres, que contêm pigmentos sensíveis à luz, os rodopsinas (RHS). Os rhabdomeres de seis PRs (R1-R6) formar um trapézio e conter Rh1 ^{3 4.} Os rhabdomeres de R7 e R8 são posicionadas em conjunto no centro do trapézio e partilhar o mesmo caminho de luz. R7 e R8 PRs estocasticamente expressar diferentes combinações de RHS em dois principais subtipos ^5: Em subtipo 'p', RH3 em p R7s é acoplado com RH5 em p R8s, enquanto no subtipo do 'y', RH4 em y R7s está associada RH6 em y R8s ^{6 7 8.}

As primeiras especificações de RP e desenvolvimento de omatídeos começa no disco de olhos antenal larval imaginal, uma monocamada de células epiteliais. Uma onda de diferenciação varre o disco ⁹ e inicia a montagem de células indiferenciadas em omatídeos ^10-11. R8 a "célula fundador 'é especificada primeiro e recruta R1-6 e depois R7 ^12-14. Posteriormente, durante o desenvolvimento pupal, diferenciação PR leva a grandes mudanças morfológicas ^15, incluindo a formação rhabdomere, sinaptogênese e expressão eventualmente rh.

Neste protocolo, descrevemos métodos para dissecção da retina e imunohistoquímica em três períodos definidos de desenvolvimento da retina, o que pode ser aplicada para resolver uma variedade de questões relativas à formação da retina e vias de desenvolvimento. Aqui, usamos esses métodos para visualizar a diferenciação PR gradual no nível de uma única célula em toda montagem larval, midpupal e retinas adulto ( <sTrong> Figura 1).

Protocol

1. Introdução Neste vídeo, descrevemos métodos para dissecção da retina e imunohistoquímica em três períodos de desenvolvimento definidos: o terceiro ínstar, o midpupal ea fase adulta. Embora nosso protocolo também funciona para outras fases de pupa (para mais detalhes sobre etapas anteriores, consulte 16), que escolheu o palco midpupal, pois é ideal para imagens de todos os PRs em um plano focal e seus núcleos são facilmente identificáveis, o que facilita a visualiza…

Discussion

1. Solução de problemas

Em nossa experiência, dissecções requerem prática (várias semanas) e são facilitados por alcançar uma posição confortável da mão ²¹ por descansar os cotovelos e antebraços sobre a mesa e com os dedos fazendo contato com o prato dissecção. Dedos Dessa forma, apenas os polegares o índice e meio realizar movimentos sutis.

Remover a lâmina sem danificar os fotorreceptores é provavelmente o passo mais desafiador. Prá…

Materials

			Reagent
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4)	Sigma		Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections.
Triton-X 100	Sigma	9002-93-1	Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature.
37% formaldehyde solution	Fisher Scientific	F75P1GAL	Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice.
5% normal horse serum	Jackson Immuno Research	008-000-001	Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees.
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647)	Invitrogen Molecular Probes	A11015 A31572 A31571	Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees.
Alexa Fluor 488 Phalloidin		A12379	Dilute 1:100 in secondary antibody solution.
Slowfade Gold Antifade reagent	Invitrogen Molecular Probes	S36936	Mounting medium. Store at -20 degrees.
Glycerol	Fisher Scientific	G31-1	For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp.
CO2			For anesthetizing adult flies.
			Equipment
Two sharp forceps (Dumont #55)	Fine Science Tools	11255-20
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture.
Three-well glass dissection dishes	Fisher Scientific	21-379
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm)	Fine Science tools	26002-10	Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook.
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1)	Fisher Scientific	12-542A
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned)	Fisher Scientific	12-550-143
1.5 ml microcentrifuge tubes
Clear nail polish or Scotch tape
Orbital shaker	Bellco
Slide holder box	Fisher Scientific
Parafilm	Bemis	PM996
Thin paintbrush
P20 and P200 micropipettes and tips
Dissecting microscope
Small bucket with ice			For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions.