Dissektion och Immunohistokemi av larver, pupal och vuxna<em> Drosophila</em> Näthinnor
Summary
Den<em> Drosophila</em> Näthinnan är en kristall-liknande gitter bestående av ett mindre antal celltyper som genereras i en stereotyp sätt<sup> 1</sup>. Dess mottaglighet för avancerade genetisk analys gör det möjligt att studera komplexa utvecklingsprogram. Detta protokoll beskriver dissektioner och immunohistokemi av näthinnor vid tre diskreta utvecklingsstadier, med fokus på ljusmätare differentiering.
Abstract
Föreningen öga Drosophila melanogaster består av cirka 750 ommatidia (enhet ögon). Varje ommatidium består av omkring 20 celler, inklusive lins-utsöndrande kon celler, pigment, ett borst cell och åtta fotoreceptorer (PRS) R1-R8 2. PRS har specialiserat microvillar strukturerna, rhabdomeres, som innehåller ljuskänsliga pigment, de Rhodopsins (hö axel). De rhabdomeres av sex PRS (R1-R6) bildar en trapets och innehåller RH1 3 4. De rhabdomeres av R7 och R8 är placerade i tandem i mitten av trapetsoiden och dela samma väg för ljus. R7 och R8 PRS uttrycker stokastiskt olika kombinationer av RHS i två subtyper 5: I "P" subtyp är Rh3 i p R7s tillsammans med RH5 i p R8s, medan i "y" subtyp är RH4 i y R7s samband med RH6 i y R8s 6 7 8.
Tidig specifikation av PRS och utveckling ommatidia börjar i larver ögat antenn imaginal skiva ett monolager av epitelceller. En våg av differentiering sveper över skivan 9 och initierar montering av odifferentierade celler i ommatidia 10-11. Den grundare cell "R8 anges först och rekryterar R1-6 och sedan R7 12-14. Därefter, under pupal utveckling leder PR differentiering till omfattande morfologiska förändringar 15, inklusive rhabdomere bildning, synaptogenes och så småningom rh uttryck.
I detta protokoll beskriver vi metoder för näthinnan dissektioner och immunohistokemi på tre perioder för näthinnan utveckling som kan tillämpas för att lösa ett antal frågor om retinal bildning och utvecklingsbanor. Här använder vi dessa metoder för att visualisera den stegvisa PR-differentiering vid encelliga nivå i hela mount larver, midpupal och vuxna näthinnor ( <sTrong> Figur 1).
Protocol
Discussion
1. Felsökning
Enligt vår erfarenhet dissektioner kräver praktik (upp till flera veckor) och underlättas genom att uppnå en bekväm handställning 21 genom att vila armbågarna och underarmar på bordet och med fingrarna i kontakt med dissektion maträtt. På så sätt bara tummen, pekfingret och långfingret utför subtila rörelser.
Ta bort skivan utan att skada fotoreceptorerna är förmodligen den mest utmanande steget. Öva med rödögd vildtyp f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en Ehrman gemenskap till HY. H., en Jane Coffin Childs Minnesfond för medicinsk forskning postdoktorsstipendium till RJJ, NIH Grant F32EY016309 till DV, en New York University Dean avhandling Fellowship till DJ, NIH GrantR01 EY13010 till CD och en DFG gemenskap till JR (RI 2208/1- 1). Vi tackar Nina Vogt och Pamela Boodram för kommentarer på manuskriptet.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).
- O’Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
- Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
- Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
- Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
- Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
- Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
- Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
- Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
- Wolff, T., Sullivan, W. e. a. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. , (2000).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
- Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. 유전학. 152, 1631-1639 (1999).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
- Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
- Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
- Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).
