Laser-Påført skade af zebrafisk Embryonale skeletmuskulatur

Summary

Den metode, der præsenteres her omfatter den præcise skade af levende zebrafisk embryoner med højenergi-laserpulser og den efterfølgende analyse af disse skader og deres opsving med tiden. Vi viser også, hvordan genetisk mærkede enkelt eller grupper af skeletmuskelceller kan spores under og efter laserlys skader.

Abstract

Forskellige eksperimentelle metoder er blevet anvendt i mus for at inducere muskel skade med det formål at studere muskelregenerationen, herunder myotoxin injektioner (bupivacain, cardiotoxin og notexin), muskel transplantationer (denervering-devascularization induceret regeneration), intensiv træning, men også murine muskeldystrofi modeller såsom MDX mus (for en gennemgang af disse tilgange se ^1). I zebrafisk, indbefatter genetiske tilgange mutanter, som udviser muskeldystrofi fænotyper (f.eks runzel ² eller sapje ³⁾ og antisense-oligonukleotid morpholinos, der blokerer ekspression af dystrofi-associerede gener ^4. Desuden kemiske metoder er også mulige, fx med Galanthamin, en kemisk forbindelse inhibere acetylcholinesterase, hvilket resulterer i hypercontraction, som i sidste ende fører til muskelsvind ^5. Men genetiske og farmakologiske metoder generally påvirker alle muskler i et individ, hvorimod omfanget af fysisk påført skader er mere let kontrolleres rumligt og tidsligt ^1. Lokaliseret fysisk skade det muligt at vurdere kontralaterale muskler som en intern kontrol. Faktisk har vi for nylig anvendte laser-medieret celle ablation at studere skeletmuskulaturen regenerering i zebrafisk embryo ^6, mens en anden gruppe nylig rapporteret anvendelsen af et to-foton laser (822 nm) at skade meget lokalt plasmamembranen af individuelle embryonisk zebrafisk muskel celler ^7.

Her rapporterer vi en fremgangsmåde til anvendelse af micropoint laser (Andor Technology) for skeletmuskulatur cellebeskadigelse i zebrafisk embryo. The micropoint laser er en højenergi-laser, som er egnet til målrettet celle ablation ved en bølgelængde på 435 nm. Laseren er forbundet til et mikroskop (i vores setup, et optisk mikroskop fra Zeiss) på en sådan måde, at mikroskopet kan anvendes samtidigt feller fokuserer laserlyset ned på prøven, og til visualisering af virkningerne af sårdannelsen (lysfelt eller fluorescens). Parametrene til styring laserimpulser omfatter bølgelængde, intensitet og antal af pulser.

På grund af sin åbenhed og ekstern embryonale udvikling, zebrafisk embryo er meget modtagelig for både laser-induceret skade og for at studere den efterfølgende opsving. Mellem 1 og 2 dage efter befrugtning, somitic skeletmuskelceller gradvis undergår modning fra anterior til posterior følge progressionen af somitogenesis fra stammen til halen ^{8, 9.} På disse stadier, spontant embryoner spjæt og indlede svømning. The zebrafisk er for nylig blevet anerkendt som en vigtig vertebrat modelorganisme til undersøgelse af vævsregeneration, som mange typer af væv (hjerte, neuronal, vaskulær etc.) kan regenereres efter skade i den voksne zebrafisk ^{10, 11.}

Protocol

1. Mærkning enkeltceller Injicere en celle embryoer med et plasmid, der koder for GFP eller GFP-fusionsproteinet under kontrol af en β-actin-promotoren. Under udvikling er GFP udtrykkes derefter i en mosaik mode. Her anvendte vi det transgene konstrukt Tg [β-actin: α-actinin-GFP], hvilket placerer α-actinin-GFP-fusionsproteinet under kontrol af β-actin-promotoren. 2. Embryo Embedding Saml zebrafisk embryoner og unde…

Representative Results

Laser-medieret skade blev udført på immobiliserede 1 dag-gamle embryoner. Som vist i figur 1, kan et par laserpulser genererer et lille sår, let genkendelig af de beskadigede, snoede, Actin-rige myofibriller, der normalt udspændt mellem somit grænser. Et højere antal laserimpulser vil dog resultere i et massivt beskadiget somit blok, hvor de fleste myofibriller bliver ødelagt. Ikke desto mindre kan vi bogstaveligt konstatere, at "tiden læger alle sår", med små skader healing hurtiger…

Discussion

Laser-medieret læsion er en kraftfuld metode til at påføre sår med en ønsket størrelse ved at ablatere celler for at studere regeneration under kontrollerede forhold i zebrafisk embryo. Især kan celler være målrettet præcist (fig. 2), og både den skade område samt timing kan styres. Efterfølgende bliver skadestedet og regenerationsprocesser let kontrolleres, registreres (fig. 3) og analyseret (figur 1). Selv om laseren er udmærket fokuseret i x-og y-aksen,…

Materials

Heating block
Pair #5 forceps	Dumont
Glass slides	Menzel		76 x 26 mm
Coverslips	Roth		50 x 24 mm #1
Petroleum jelly
Stereomicroscope	Leica		MZFLIII
Micropoint laser	Andor Technology
Fluorescence microscope	Zeiss		Axioplan II
Metamorph software	Molecular devices
			Reagents Low-melting point agarose ( #50081, Lonza) Tricaine stock solution: 400 mg Tricaine (#A-5040, Sigma-Aldrich ) / 100 ml dH2O pH 9.0 E3 medium (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)