פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה
Summary
השיטה שהוצגה כאן מהווה פגיעה המדויקת של עוברי דג זברה לחיות עם פעימות ליזר באנרגיה גבוהה ועל ניתוח בדיעבד של פגיעות אלה וההתאוששות שלהם עם זמן. אנו גם מראים איך שכותרת גנטית בודדה או קבוצות של תאי שריר שלד יכולות להיות במעקב בזמן ואחרי ניזק מושרה אור ליזר.
Abstract
גישות ניסיוניות שונות שמשו בעכבר כדי לגרום לפגיעה בשרירים במטרה ללמוד התחדשות שרירים, לרבות זריקות myotoxin (bupivacaine, cardiotoxin או notexin), השתלות שרירים (התחדשות המושרית denervation-devascularization), פעילות גופנית אינטנסיבי, אלא גם מודלי ניוון שרירי Murine כגון עכבר MDX (לסקירה של גישות אלה ראו 1). בדג הזברה, גישה גנטית, כוללת מוטציות שמראות פנוטיפים ניוון שרירים (כגון runzel 2 או sapje 3) וantisense morpholinos oligonucleotide שחוסם את הביטוי של גנים הקשורים למחלת ניוון 4. חוץ מזה, גישות כימיות גם אפשריות, למשל עם Galanthamine, acetylcholinesterase עיכוב תרכובת כימית, ובכך וכתוצאה מכך hypercontraction, שסופו של דבר מוביל לניוון שרירים 5. גישות עם זאת, גנטיות ותרופתיות גרמוenerally משפיעים על כל השרירים בתוך אדם, ואילו את ממד הניזק שנגרם מבחינה פיזית נשלטים מרחב ובזמן 1 בקלות רבה יותר. פגיעה פיזית מקומית מאפשרת הערכה של שריר נגדי כבקרה פנימית. ואכן, השתמש לאחרונה אבלציה תא ליזר בתיווך ללמוד התחדשות שרירי שלד בעובר דג הזברה 6, ואילו קבוצה אחרת דיווחה לאחרונה את השימוש בשני פוטוני ליזר (822 ננומטר) לפגוע בקרום הפלזמה של שריר דג זברה עוברי בודד מאוד באופן מקומי תאים 7.
כאן, אנו מדווחים על השימוש בשיטת micropoint הליזר (יידור טכנולוגיה) לפציעת תא שריר שלד בעובר דג הזברה. ליזר micropoint הוא ליזר באנרגיה גבוה אשר מתאימה לאבלציה תא הממוקדת באורך גל של 435 ננומטר. הליזר מחובר למיקרוסקופ (בהגדרה שלנו, מיקרוסקופ אופטי מZeiss) באופן כזה שמיקרוסקופ ניתן להשתמש באותו הזמן ואו התמקדות אור הליזר על המדגם ולדמיין את ההשפעות של הפציעה (brightfield או פלואורסצנטי). הפרמטרים לשליטת פעימות ליזר כוללים אורך גל, עצמה, ומספר הפעימות.
בשל שקיפותו והתפתחותו של עובר חיצונית, עובר דג הזברה הוא נוח מאוד לצרכי פגיעת ליזר מושרה וללימוד ההתאוששות שלאחר מכן. בין 1 ו 2 ימים לאחר הפריה, תאי שריר שלד somitic הדרגה לעבור התבגרות מקדמית לאחורי עקב התקדמות somitogenesis מהגזע עד הזנב 8, 9. בשלבים אלה, עובר באופן ספונטני להתעוות וליזום שחייה. דג הזברה לאחרונה הוכר כאורגניזם מודל חוליות חשובה למחקר של התחדשות רקמות, כמו סוגים רבים של רקמות (לב, עצבים, כלי דם וכו ') יכול להיות מחדש לאחר פציעה בדג הזברה המבוגר 10, 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
פגיעת ליזר בתיווך היא שיטה רבה עצמה לגרימת פצעים בגודל רצוי על ידי ablating תאים כדי ללמוד התחדשות בתנאים מבוקרים בעובר דג הזברה. יש לציין, תאים יכולים להיות ממוקדים בדיוק (איור 2) והן באזור הפציעה, כמו גם העיתוי יכול להיות נשלט. כתוצאה מכך, פגיעה באתר ותהליכי התחד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לבוב נובאק (יידור טכנולוגיה) לקבלת עזרה וייעוץ טכני. SA-S. הוא נתמך על ידי מלגה של הייזנברג Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG). עבודה זו נתמכה על ידי המענק SE2016/7-1 DFG.
Materials
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
|
References
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol. Rev. 84, 209-238 (2004).
- Steffen, L. S. The zebrafish runzel muscular dystrophy is linked to the titin gene. Dev. Biol. 309, 180-192 (2007).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 358-363 (2011).
- Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strähle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol. Sci. 77, 325-333 (2004).
- Otten, C., et al. Xirp proteins mark injured skeletal muscle in zebrafish. PLoS One. 7, e31041 (2012).
- Roostalu, U., Strähle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev. Cell. 22, 515-529 (2012).
- Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev. Dyn. 219, 287-303 (2000).
- Stellabotte, F., Dobbs-McAuliffe, B., Fernandez, D. A., Feng, X., Devoto, S. H. Dynamic somite cell rearrangements lead to distinct waves of myotome growth. Development. 134, 1253-1257 (2007).
- Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr. Top. Dev. Biol. 100, 319-344 (2012).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev. Biol. 365, 339-349 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. , 203-253 (1995).
