Genoom-brede gendeleties in<em> Streptococcus sanguinis</em> Door High Throughput PCR

Summary

Een efficiënte genoom-brede enkel gen mutatie methode is vastgesteld aan de hand<em> Streptococcus sanguinis</em> Als modelorganisme. Deze methode heeft bereikt via high throughput recombinant PCRs en transformaties.

Abstract

Transposon mutagenese en single-gendeletie zijn twee methoden toegepast genoom knockout in bacteriën ^1,2. Hoewel transposon mutagenese is minder tijdrovend, minder duur en vereist geen voltooid genoominformatie zijn er twee zwakke punten in deze werkwijze: (1) de mogelijkheid van een heterogene mutanten in de gemengde mutant bibliotheek die tegen de mutanten geselecteerd met verminderde concurrentie; en (2) de mogelijkheid van gedeeltelijke geninactivering waarbij genen niet geheel verliezen hun functie na het inbrengen van een transposon. Single-gendeletie analyse kan compenseren voor de nadelen van transposon mutagenese. Om de efficiëntie van genoom-brede enkele gendeletie te verbeteren, proberen we een high-throughput techniek voor genoom-wijde enkele gendeletie met Streptococcus sanguinis als een model organisme. Elk gen in S. deletieconstruct sanguinis genoom ontworpen om 1 omvat-Kb stroomopwaarts van het targetgen, de APHA-3-gen, dat codeert voor kanamycine resistentie-eiwit, en 1 kb stroomafwaarts van het targetgen. Drie sets van primers F1/R1, F2/R2 en F3/R3 respectievelijk zijn ontworpen en gesynthetiseerd in een 96-well plaat formaat voor PCR-amplificaties van deze drie componenten van elke deletieconstruct. Primers R1 en F3 bevatten 25-bp sequenties die complementair zijn aan gebieden van de APHA-3 gen einde hun 5'. Een grootschalige PCR amplificatie van de APHA-3 gen wordt eenmaal uitgevoerd voor het maken van alle enkel gen deletieconstructen. De promotor van APHA-3 gen aanvankelijk niet het potentiële effect van kanamycine polaire cassette minimaliseren. De gendeletie constructies te realiseren, worden high-throughput PCR amplificatie en zuivering uitgevoerd in een 96-well plaat formaat. Een lineaire recombinant PCR amplicon voor elk gen deletie wordt samengesteld door vier PCR-reacties met high-fidelity DNA polymerase. De initiële exponpreferentiële groeifase van S. sanguinis gekweekt in Todd Hewitt bouillon aangevuld met 2,5% geïnactiveerd paardenserum wordt de bekwaamheid verhogen voor de transformatie van PCR-recombinant constructen. Onder deze voorwaarde, tot 20% van S. sanguinis cellen kunnen worden getransformeerd met ~ 50 ng DNA. Op basis van deze benadering werden 2.048 mutanten met enkele gendeletie uiteindelijk verkregen uit de 2.270 genen in S. sanguinis met uitzondering van vier gen ORFs die volledig binnen andere ORFs in S. sanguinis SK36 en 218 potentiële essentiële genen. De techniek voor het maken gendeletie constructen high throughput en kan gemakkelijk in genoom gen deleties gebruiken voor transformeerbaar bacteriën.

Protocol

1. Primer ontwerp Primers zijn ontworpen met behulp huis scripts gebaseerd op de S. sanguinis SK36 genoomsequentie. Drie sets van primers, F1/R1, F2/R2 en F3/R3 zijn ontworpen voor amplificatie van de 1-kb stroomopwaartse sequentie van het doelwitgen, de APHA-3 gen dat codeert voor kanamycine resistentie (Km r) eiwit 3 en de 1 -kb stroomafwaartse sequentie van het doelwitgen, respectievelijk (Figuur 1). Van deze primers wordt F1 en R3 ontworpen met ePri…

Representative Results

After PCR amplification using primers F1 and R1, and F3 and R3, approximately 1-kb upstream and downstream of each S. sanguinis gene were obtained in 96-well format, respectively (Figure 2A). Under our PCR conditions and using designed primers, a specific product was amplified from S. sanguinis genomic DNA in each PCR reaction. This result indicated the primers were highly specific to the targets of S. sanguinis. Through PCR re-amplification using primers F1 and R3 and t…

Discussion

Om de mogelijke polaire effecten van de vervanging van een targetgen met exogeen gen antibiotica op naburige genen minimaliseren, worden twee stappen terwijl de initiële primer ontwerpen. Voor de meeste van verwijderde genen, de primers R1 en F3 om de coderende regio 6 bp verwijderen na het startcodon tot 30 bp vóór het stopcodon. De laatste 30 basenparen vastgehouden mogelijke ribosomale bindingsplaats die de aangrenzende downstream gen beschermen. De bewaarde gebied tussen twee naburige genen wordt uitgebreid tot 1…

Materials

Names	Company	Catalog#	Comments (optional)
Primer F2	Integrated DNA Technologies		TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
Primer R2	ibid		CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
Primer F2p	ibid		GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
Primer P1	ibid		GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
Primer P2	ibid		GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
Primer 5′ end_R1_seq	ibid		GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
Primer 5′ end_F3_seq	ibid		GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
Primer 5′ end_R1p_seq	ibid		CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep		Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
DNA Polymerase	Invitrogen	11304-102	Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity
EcoRI	New England Biolabs Inc	R0101S	Restriction enzyme
Agar	American Bioanalytical	AB01185
Agarose	Promega	V3125
BHI	BD Biosciences	237500	Brain Heart Infusion
Horse serum	Fisher Scientific	SH3007403	Horse serum
Km	Fisher Scientific	BP906-5	Kanamycin
TH broth	BD Biosciences	249240	Todd Hewitt broth
PureLink 96	Invitrogen	K310096	PureLink 96 PCR purification kit
QIAquick	Qiagen	28106	QIAquick PCR purification kit
Filter	Corning	431117	0.22 μm polystyrene filter
Anoxomat System	Mart Microbiology b.v.	Anoxomat Mark II
Benchtop centrifuge	Thermo Scientific	75004377	Sorvall Legend RT Plus microplate rotor
Gel Documentation	UVP LLC	BioDoc-It 210
Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	Isotemp
Labnet’s Gel XL	Labnet	E0160	Labnet’s Gel XL
Microcentrifuge	Eppendorf	22621408	Microcentrifuge 5415 R
Multichannel pipettes	Thermo Scientfic	4661040, 4661020	Finnpipette F1
Thermal Cycler	Applied Biosystems Inc.	N805-0200	GeneAmp PCR system 9700