מחיקות Gene הגנום ב<em> סטרפטוקוקוס sanguinis</em> על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Summary

שיטה יעילה הגנום בודדה גן מוטציה כבר נקבעה באמצעות<em> סטרפטוקוקוס sanguinis</em> כאורגניזם מודל. שיטה זו השיגה דרך PCRs גבוה התפוקה רקומביננטי ותמורות.

Abstract

Transposon mutagenesis ומחיקה של גן היחיד הם שתי שיטות שיושמו בנוקאאוט גן גנום רחב ^ב1,2 חיידקים. למרות mutagenesis transposon הוא פחות זמן רב, יקר פחות, ואינו דורש מידע הגנום הושלם, יש שתי חולשות בשיטה זו: (1) האפשרות של מוטציות שונות בספריית המוטציה המעורבת שנגד בוחרת מוטנטים עם תחרות ירד; ו (2) האפשרות של איון גן החלקי לפיו גנים לא לגמרי מאבדת את תפקודם לאחר החדרת transposon. ניתוח מחיקה של הגן יחיד עשוי לפצות על חסרונות הקשורים mutagenesis transposon. כדי לשפר את היעילות של מחיקה הגנום בודדה גן, אנו מנסים להקים טכניקת תפוקה גבוהה למחיקת גן יחידה הגנום באמצעות sanguinis Streptococcus כאורגניזם מודל. כל מחיקת גן לבנות בס sanguinis הגנום נועד מהווה 1-KB זרם של הגן הממוקד, גן APHA-3, חלבון התנגדות kanamycin קידוד, או במורד 1-KB של הגן הממוקד. שלושה זוגות של פריימרים F1/R1, F2/R2, וF3/R3, בהתאמה, מתוכננים ומסונתזים בפורמט צלחת 96-גם ל- amplifications PCR של שלושה המרכיבים האלה של כל מחיקה להקים. Primers R1 ו F3 מכילים רצפי 25-BP שמשלימים לאזורים של-3 APHA הגן בקצה 5 'שלהם. הגברת PCR קנה מידה גדולה של-3 APHA הגן מתבצעת פעם אחת ליצירה כל מבני המחיקה בגן בודד. האמרגן של גן APHA-3 בתחילה הוצא כדי למזער את ההשפעה הפוטנציאלית של קוטב קלטת kanamycin. כדי ליצור מבני מחיקת הגן, הגברת תפוקה גבוהה PCR וטיהור מבוצעות בפורמט צלחת 96-כן. Amplicon PCR רקומביננטי יניארית לכל מחיקת גן יהיה מורכב באמצעות ארבע תגובות PCR באמצעות DNA פולימראז באיכות גבוהה. Expon הראשונישלב הצמיחה ential של ס ' sanguinis תרבית בטוד יואיט מרק בתוספת 2.5% סרום סוס מומת משמש כדי להגדיל את היכולת של שינוי מבני PCR-רקומביננטי. תחת תנאי זה, עד 20% של ס ' תאי sanguinis ניתן להפוך באמצעות ~ 50 ng של DNA. בהתבסס על גישה זו, 2048 מוטנטים עם מחיקת גן יחיד סופו של דבר התקבלו מ2270 הגנים בס sanguinis למעט 4 ORFs גנים כלולים כולו בתוך ORFs האחר בס sanguinis SK36 ו218 גנים חיוניים פוטנציאליים. הטכניקה ביצירת מבני מחיקת גן היא תפוקה גבוהה ויכולה להיות קל לשימוש במחיקות גן יחידות הגנום לכל חיידקי transformable.

Protocol

1. עיצוב פריימר Primers תוכנן באמצעות תסריטים בבית המבוסס על ס רצף הגנום sanguinis SK36. שלושה זוגות של פריימרים, F1/R1, F2/R2, וF3/R3 מיועדים להגברה של רצף 1-kb במעלה הזרם של גן המטרה, התנגדות APHA-3 גן קידוד kanamycin (הק"מ R)</su…

Representative Results

After PCR amplification using primers F1 and R1, and F3 and R3, approximately 1-kb upstream and downstream of each S. sanguinis gene were obtained in 96-well format, respectively (Figure 2A). Under our PCR conditions and using designed primers, a specific product was amplified from S. sanguinis genomic DNA in each PCR reaction. This result indicated the primers were highly specific to the targets of S. sanguinis. Through PCR re-amplification using primers F1 and R3 and t…

Discussion

כדי למזער את ההשפעות האפשריות של קוטב החלפת הגן ממוקד אחד עם אנטיביוטיקת גן אקסוגני בגנים סמוכים, שני צעדים נלקחים תוך פריימר הראשוני בעיצוב. עבור רוב הגנים שנמחקו, פריימרים R1 ו F3 נועדו למחוק את אזור קידוד מ6 נ"ב לאחר קודון התחילה ועד 30 נ"ב לפני קודון העצירה. את 30 ז…

Materials

Names	Company	Catalog#	Comments (optional)
Primer F2	Integrated DNA Technologies		TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
Primer R2	ibid		CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
Primer F2p	ibid		GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
Primer P1	ibid		GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
Primer P2	ibid		GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
Primer 5′ end_R1_seq	ibid		GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
Primer 5′ end_F3_seq	ibid		GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
Primer 5′ end_R1p_seq	ibid		CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep		Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
DNA Polymerase	Invitrogen	11304-102	Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity
EcoRI	New England Biolabs Inc	R0101S	Restriction enzyme
Agar	American Bioanalytical	AB01185
Agarose	Promega	V3125
BHI	BD Biosciences	237500	Brain Heart Infusion
Horse serum	Fisher Scientific	SH3007403	Horse serum
Km	Fisher Scientific	BP906-5	Kanamycin
TH broth	BD Biosciences	249240	Todd Hewitt broth
PureLink 96	Invitrogen	K310096	PureLink 96 PCR purification kit
QIAquick	Qiagen	28106	QIAquick PCR purification kit
Filter	Corning	431117	0.22 μm polystyrene filter
Anoxomat System	Mart Microbiology b.v.	Anoxomat Mark II
Benchtop centrifuge	Thermo Scientific	75004377	Sorvall Legend RT Plus microplate rotor
Gel Documentation	UVP LLC	BioDoc-It 210
Incubator	Fisher Scientific	11-690-625D	Isotemp
Labnet’s Gel XL	Labnet	E0160	Labnet’s Gel XL
Microcentrifuge	Eppendorf	22621408	Microcentrifuge 5415 R
Multichannel pipettes	Thermo Scientfic	4661040, 4661020	Finnpipette F1
Thermal Cycler	Applied Biosystems Inc.	N805-0200	GeneAmp PCR system 9700