По всему геному Гена удаления в<em> Streptococcus sanguinis</em> По высокая пропускная способность ПЦР
Summary
Эффективное генома одного метода генной мутации была создана использования<em> Streptococcus sanguinis</em> В качестве модельного организма. Этот метод осуществляется через высокую пропускную способность рекомбинантного ПЦР и преобразований.
Abstract
Транспозонов мутагенеза и одного гена удаления двух методов, применяемых в генома генов нокаутом в 1,2 бактерии. Хотя транспозона мутагенеза является менее трудоемким и менее дорогостоящими, и не требует завершить геноме информации, есть два слабых места в этом методе: (1) возможность разных мутантов в смешанном мутант библиотека, которая по борьбе с мутантами выбирает со снижением конкуренции; и (2) возможность частичной инактивации гена которой гены не полностью теряют свои функции после введения транспозона. Одного гена удаления анализа могут компенсировать недостатки, связанные с мутагенеза транспозонов. Для повышения эффективности генома одного делеции гена, мы пытаемся установить высокую пропускную техника для генома одного удаления гена с использованием Streptococcus sanguinis в качестве модельного организма. Каждый ген удаления построить в S. sanguinis генома предназначен для составляющих 1КБ вверх по течению от целевого гена, APHA-3 гена, кодирующего белок канамицину и 1-кб ниже целевого гена. Три комплекта F1/R1 грунтовки, F2/R2, и F3/R3, соответственно, разработан и синтезирован в 96-луночный планшет формата для ПЦР-амплификации из этих трех компонентов каждого удаления построить. Грунтовки R1 и F3 содержат 25-BP последовательности, которые являются дополнением к регионам APHA-3 гена в конце их 5. Крупномасштабных ПЦР-амплификации APHA-3 гена выполняется один раз для создания всех одно-генных конструкций удаления. Промоутер APHA-3 гена изначально исключены чтобы свести к минимуму потенциальные полярный эффект кассетного канамицин. Для создания конструкции гена удаления, высокой пропускной ПЦР-амплификации и очистки осуществляется в 96-луночный планшет формата. Линейные рекомбинантного ампликона ПЦР для каждого гена удаление будет составлен через четыре реакции ПЦР с использованием высококачественных ДНК-полимеразы. Первоначальный EXPONдифференциальной фазы роста S. sanguinis культивировали в Todd Hewitt бульоне с добавлением 2,5% инактивированной лошадиной сыворотки используется для повышения компетенции для преобразования ПЦР-рекомбинантной конструкции. При этом условии до 20% С. sanguinis клетки могут быть трансформированы ~ 50 нг ДНК. Основываясь на этом подходе, 2048 мутанты с одного гена удаления в конечном итоге были получены из 2270 генов S. sanguinis учета ORFs четыре гена, целиком в рамках других ORFs в S. sanguinis SK36 и 218 потенциальных существенных генов. Техника на создание конструкции ген удаления высокой пропускной способностью и может быть легко использовать в генома одного удаления гена для любого трансформируемые бактерий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы свести к минимуму возможные полярные эффекты замены одного целевого гена с экзогенного гена антибиотиков на соседние гены, две шаги при начальном проектировании грунтовки. Для большинства удалены гены, праймеры R1 и F3 предназначены для удаления кодирующей области от 6 б.п. после с…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами R01DE018138 из Национального института здоровья (ПВ) и, частично, Virginia Commonwealth University президентской программы стимулирования исследований (Прип) 144602-3 (PX). Мы благодарим доктора. Лей Чен, Yuetan Доу и Xiaojing Ван для оказания помощи в строительстве генома широкий мутантов. Мы также благодарим фонд ДНК ядра в Virginia Commonwealth University для секвенирования ДНК.
Materials
| Names | Company | Catalog# | Comments (optional) |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5′ end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5′ end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5′ end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet’s Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet’s Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
- Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis. Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).
- Kobayashi, K., et al. Essential Bacillus subtilis genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).
- Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3’5″-aminoglycoside phosphotransferase type III. Gene. 23, 331-341 (1983).
- Paik, S., et al. Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis. Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).
- Lukomski, S., et al. Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization. Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, (2006).
- de Berardinis, V. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol. Syst. Biol. 4, 174 (2008).
- Rodriguez, A. M., et al. Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis. Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).
- Perry, D., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect. Immun. 32, 1295-1297 (1981).
- Pakula, R., Walczak, W. On the nature of competence of transformable streptococci. J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Xu, P., et al. Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis. Sci. Rep. 1, (2011).
